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Aprovechamiento de los pseudovirus frente a la pandemia COVID-19

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Aprovechamiento de los pseudovirus frente a la pandemia COVID-19

Crédito: Pixabay.
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El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo SARS-CoV-2 ha causado la mundial pandemia de COVID-19 y tuvo un impacto devastador en la vida y el sustento de los seres humanos desde diciembre de 2019. Sin embargo, los increíbles esfuerzos de los científicos y las agencias de salud pública en todo el mundo han dado como resultado la autorización de uso de emergencia y el rápido despliegue de contramedidas basadas en anticuerpos, incluidos los anticuerpos monoclonales terapéuticos.mAb, terapia con plasma de convalecencia y ARN mensajero, inactivado y vectorizado por virus vacunas . El éxito de las contramedidas basadas en anticuerpos depende de la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la infección por SARS-CoV-2 al unirse a la glucoproteína pico S del SARS-CoV-2, con la que normalmente se une a la enzima convertidora de angiotensina2 ACE2 en las células huésped para lograr la entrada celular. La eficacia de los anticuerpos se mide típicamente en un ensayo de neutralización. Sin embargo, este ensayo requiere aislamiento y manipulación del SARS-CoV-2 en a Nivel de bioseguridad 3 BSL-3 laboratorio siguiendo las prácticas BSL-3 según pautas de bioseguridad de los CDC . Los laboratorios BSL-3 se limitan a unas pocas instituciones, lo que restringe el alcance para evaluar el éxito de las contramedidas basadas en anticuerpos. Una alternativa viable sería utilizar un pseudovirus en lugar de SARS-CoV-2 en estos ensayos de neutralización. Pseudoviruspuede manipularse de forma segura en los laboratorios BSL-2 de rutina que están ampliamente disponibles y se utilizan a gran escala, lo que abre oportunidades para el avance terapéutico.

Definición de pseudovirus


Los pseudovirus son quimeras sintéticas que consisten en un núcleo viral sustituto, derivado de un virus parental, y una glicoproteína de envoltura en su superficie derivada de un virus heterólogo. 1 El virus original utilizado para generar un pseudovirus es típicamente un rabdovirus p. Ej., Virus de la estomatitis vesicular VSV o un retrovirus p. Ej., Virus de la leucemia murina MLV o virus de inmunodeficiencia humana 1 VIH-1 1 . El genoma viral original se modifica para eliminar los genes esenciales necesarios para la replicación, incluido el gen de la glicoproteína de la envoltura nativa, y en su lugar, se inserta un gen indicador que codifica la luciferasa o la proteína fluorescente. 1 Por lo tanto, los pseudovirus son defectuosos para someterse a un ciclo de replicación completo y solo pueden sufrir un único ciclo de infección. 1


Figura 1:
Los pseudovirus que expresan la glicoproteína SARS-CoV-2 S se unen al receptor ACE2 en la superficie de las células huésped donde la proteasa TMPRSS2 escinde S, lo que da como resultado un cambio conformacional y la fusión de las membranas de las células virales y del huésped. Tras la fusión, el genoma se libera en el citoplasma celular yse expresa el reportero codificado por el genoma, cuya actividad se cuantifica mediante un instrumento.


Tras una infección exitosa de pseudovirus de las células huésped, se expresa la luciferasa informadora o la proteína fluorescente, cuya actividad se puede cuantificar usando un luminómetro o un fluorímetro respectivamente Figura 1. Dado que el paso de entrada para la infección de una célula huésped se rigedebido a la glicoproteína de la envoltura en su superficie, es imperativo que las células hospedadoras utilizadas para la infección por pseudovirus expresen receptores apropiados que se unan a la glicoproteína de la envoltura de interés. Como tales, los pseudovirus son excelentes sustitutos para estudiar las funciones relacionadas con las glicoproteínas de la envoltura y los procesos de entrada viral.Las glicoproteínas de la envoltura que median la entrada en las células huésped son uno de los principales objetivos del sistema inmunológico en la generación de anticuerpos que neutralizan la entrada viral Figura 2. 1 , 2 Por lo tanto, las glicoproteínas de la envoltura viral son de interés en el desarrollo de vacunas y mAb para muchos virus con potencial pandémico y epidémico p. Ej., Influenza, Ébola y COVID-19.



Figura 2:
Ensayo de neutralización que emplea pseudovirus que expresan la glicoproteína SARS-CoV-2 S. Los anticuerpos neutralizantes que se dirigen a la glicoproteína S previenen la unión al receptor ACE2 y, por lo tanto, los pasos posteriores de fusión, liberación del genoma y expresión del gen indicador.

plataformas de pseudovirus


Los pseudovirus son una gran ventaja para evaluar la eficacia de las vacunas y los mAb que se utilizan en modelos animales y ensayos clínicos. Se han desarrollado varios pseudovirus del SARS-CoV-2 S basados ​​en plataformas VSV, MLV y VIH y actualmente se utilizan en todo el mundo paraevaluar el éxito de las contramedidas basadas en anticuerpos.


plataforma VSV


Para fabricar pseudovirus usando una plataforma VSV, inicialmente un VSV
Δ Se debe producir el pseudovirus GG *. Esto se logra mediante la transfección de dos plásmidos, uno que codifica el genoma central del VSV que carece de la glicoproteína nativa y que contiene el gen indicador VSV Δ G, y la otra codificación de la glicoproteína de la envoltura del VSV G *, en células HEK293T susceptibles de transfección. 3 Esto da como resultado la producción de VSV Δ pseudovirus GG * que luego se pueden usar para infectar células HEK293T previamente transfectadas con un plásmido que expresa la glicoproteína SARS-CoV-2 S. El VSV Δ El genoma del pseudovirus GG * contiene todos los componentes centrales necesarios para la replicación y un gen indicador, pero carece de la glicoproteína de la envoltura necesaria para el ensamblaje y la gemación de los pseudovirus. 3 La glicoproteína de pico expresada por separado en la membrana plasmática facilita el ensamblaje y la gemación de VSV Δ pseudovirus GS. Cualquier remanente de G * del VSV Δ el pseudovirus GG * utilizado para la infección se previene mediante la adición de un anticuerpo neutralizante dirigido contra G *. El VSV Δ Los pseudovirus GS se pueden usar directamente para la infección de células HEK293T que expresan el receptor ACE2 HEK293T-ACE2 o células Vero que permiten la unión y la entrada de S. La línea de tiempo general para producir VSV Δ El pseudovirus GS dura de cinco a seis días. 3


plataforma MLV y VIH


Las plataformas MLV y VIH emplean tres plásmidos para la transfección en células HEK293T :

- un plásmido que codifica los genes centrales de MLV / VIH mordaza y pol, pero carece de la glicoproteína de la envoltura de MLV / VIH env gen

- Un plásmido de vector de transferencia que codifica luciferasa de luciérnaga o gen indicador de proteína fluorescente verde GFP, señal de empaquetamiento de Ψ-ARN, junto con regiones de repetición terminal larga LTR que flanquean 5 'y 3'

- Un plásmido que codifica la glicoproteína de la envoltura de interés, en este caso el SARS-CoV-2 S.

Dos días después de la transfección, el pseudovirus se puede recolectar y purificar para la infección de las células hospedadoras. La línea de tiempo general para producir el pseudovirus MLV-S / HIV-S es de dos días.

Ventajas y limitaciones de los pseudovirus


Como se describe a continuación, los pseudovirus ofrecen varias ventajas y algunas limitaciones en comparación con los virus nativos clasificados como agentes BSL-3 .


Ventajas


1.
Los pseudovirus son fácilmente escalables, genéticamente estables e inherentemente más seguros que los virus nativos. 1 , 4

2.
Los pseudovirus permiten el estudio de los mecanismos de entrada celular de nuevos virus emergentes y virus que no pueden cultivarse en cultivos celulares. 4

3.
El proceso de entrada de la célula huésped y el tropismo de la célula diana se pueden cuantificar mediante genes indicadores Figura 1. 1

4.
Se hace accesible el estudio de la entrada celular de virus altamente patógenos para los que se requerirían instalaciones BSL -3 o -4 de las cuales hay un acceso limitado. Como los pseudovirus son defectuosos para la replicación, pueden manejarse de manera segura en una rutinaInstalación BSL-2. 4

5.
Se pueden generar líneas celulares estables que expresan o carecen de un gen de interés. 1

6.
Se pueden producir vectores virales y vacunas para la administración de genes. 4

7.
La eficacia de las vacunas y los anticuerpos monoclonales terapéuticos se puede evaluar cuantificando los anticuerpos neutralizantes en un ensayo de neutralización Figura 2. 1

8.
Se puede estudiar el potencial terapéutico de los inhibidores de la entrada de virus. 1

limitaciones


1.
Es posible que la densidad de glicoproteínas de la superficie de la envoltura en un pseudovirus no refleje necesariamente la densidad original en el virus nativo.

2.
Aunque varios estudios han observado una correlación significativa entre la neutralización del pseudovirus y el virus nativo, algunos estudios informaron una falta de correlación entre ellos. 5

3.
Los pseudovirus generados mediante la plataforma del VIH no se pueden usar para evaluar el éxito de las contramedidas basadas en anticuerpos en personas infectadas por el VIH que reciben terapia antirretroviral TAR. La TAR involucra análogos de nucleósidos que pueden interferir con la transcripción inversa y los pasos de integración del indicadorgenes en el ensayo de neutralización, lo que conduce a falsos positivos. 1 Por lo tanto, se debe utilizar una plataforma alternativa basada en VSV o MLV.

Uso de pseudovirus en la lucha contra el SARS-CoV-2


Neerukonda et al. han desarrollado un sistema de pseudovirus SARS-CoV-2 fácil y altamente eficiente que se basa en una plataforma de VIH. 1 Aunque existen varias plataformas de pseudovirus SARS-CoV-2, el sistema desarrollado por Neerukonda et al. logra comparativamente mayores niveles de infección por pseudovirus en un período de tiempo relativamente corto, lo que permite la detección de contramedidas basadas en anticuerpos en individuos vacunados o infectados a gran escala. 1 Con el propósito de la infección por pseudovirus, diseñaron una línea celular HEK293T que expresa de manera estable un receptor ACE2 y una proteasa TMPRSS2 HEK293T-ACE2 / TMPRSS2 que soporta niveles superiores de infección por pseudovirus en comparación con cualquier otro tipo de células actualmente disponible. 1 Este ensayo,
publicado en PLOSONE , es un avance importante y actualmente está siendo empleado por científicos y agencias de salud pública en todo el mundo para la detección rápida y la prueba de contramedidas basadas en anticuerpos contra las variantes existentes y emergentes del SARS-CoV-2. Además, este sistema también se puede estudiarotros virus de importancia para la salud humana, incluidos la influenza, el ébola y la hepatitis B y C.


Referencias

1. Neerukonda, SN; Vassell, R .; Herrup, R .; Liu, S .; Wang, T .; Takeda, K .; Yang, Y .; Lin, T.-L .; Wang, W.; Weiss, CD Establecimiento de un ensayo de neutralización de pseudovirus lentivirales SARS-CoV-2 bien caracterizado utilizando células 293T con expresión estable de ACE2 y TMPRSS2. PLOS ONE . 2021, 16, e0248348. Doi : 10.1371 / journal.pone.0248348

2. Nath Neerukonda, S .; Vassell, R .; Weiss, Anticuerpos neutralizantes de CD que se dirigen a la región madre conservada de la hemaglutinina de la influenza. vacunas . 2020, 8, 382. doi : 10.3390 / vacunas8030382

3. Zettl, F .; Meister, TL; Vollmer, T .; Fischer, B .; Steinmann, J .; Krawczyk, A .; V'kovski, P .; Todt, D .; Steinmann, E .;Pfaender, S., et al.Cuantificación rápida de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante pseudotipos del virus de la estomatitis vesicular defectuosa en la propagación. vacunas . 2020, 8, 386. doi : 10.3390 / vacunas8030386

4. Millet, JK; Whittaker, GR Producción e infección de partículas pseudotipadas con pseudotipos de coronavirus basados ​​en el virus de la leucemia murina MLV. Bio Protocolos . 2016, 6, e2035, doi : 10.21769 / BioProtoc.2035

5. Wang, P .; Nair, MS; Liu, L .; Iketani, S .; Luo, Y .; Guo, Y .; Wang, M .; Yu, J .; Zhang, B .; Kwong,PD, et al.Resistencia a anticuerpos de las variantes B.1.351 y B.1.1.7 del SARS-CoV-2. Naturaleza . 20

Conozca al autor
Karen Steward PhD
Escritor científico senior
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