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Perspectiva de la industria

Uso de organoides en el estudio de enfermedades infecciosas

Perspectiva de la industria

Uso de organoides en el estudio de enfermedades infecciosas

Crédito: HUB

el cultivo de células organoides tiene ensayos basados ​​en células transformadas en el descubrimiento de fármacos y biología básica al conferir relevancia fisiológica a in vitro modelos biológicos basados ​​en células. Cuando se les proporciona un entorno de crecimiento adecuado, que incluye material de cultivo apropiado, factores de crecimiento, matriz extracelular, nutrientes y medios de cultivo, las células progenitoras derivadas de órganos recolectadas de pacientes crecen y se ensamblan en estructuras tridimensionales: organoides- que incorporan todos los tipos de células que se encuentran normalmente en el tejido original y permiten interacciones físicas y químicas entre las células. Al proporcionar una mayor relevancia fisiológica y una plataforma de prueba específica para la especie o el paciente, los organoides superan muchas limitaciones de los cultivos 2D convencionales e inclusomodelos de enfermedades de animales vivos.

Los organoides surgen de células madre pluripotentes adultas derivadas de órganos, células madre de órganos o células madre cancerosas que poseen la capacidad innata de expandirse y diferenciarse en múltiples tipos de células. Los organoides generados a partir de decenas de tejidos y órganos disponible comercialmente o accesible a través de protocolos publicados que incluyen modelos de pacientes derivados hígado , corazón, páncreas, cerebro, tracto gastrointestinal, riñón y, recientemente, de vías respiratorias humanas adecuado para el desarrollo de fármacos y vacunas y para el estudio de enfermedades respiratorias humanas infecciosas.

Las colaboraciones de la industria ayudan a avanzar en los estudios de organoides


Tecnología organoide Hubrecht HUB, una fundación ubicada en Utrecht, Países Bajos, comercializa e industrializa tecnología avanzada de organoides y distribuye organoides de origen humano en todo el mundo. La propiedad intelectual de HUB se basa en el trabajo pionero del profesor Hans Clevers, quien en 2009 describió por primera vez los métodos para cultivary la expansión de organoides epiteliales humanos derivados de células madre humanas adultas. HUB ha producido y validado organoides que representan cánceres de colon, mama, pulmón, hígado, ovario, vejiga y páncreas. Además, HUB generó modelos para otras enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinalEII, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica EPOC y enfermedades genéticas como la fibrosis quística FQ. La empresa también ha introducido organoides renales derivados de células madre adultas y continúa investigando los mecanismos moleculares del desarrollo de tejidos y el cáncer utilizando organoides generadosde células madre adultas Lgr5.

Corning Life Sciences ha colaborado con HUB desde 2014 para proporcionar organoides avanzados y tecnología relacionada.

La tecnología del Dr. Clevers permitió, por primera vez, la expansión de organoides derivados de células madre adultas en forma genéticamente estable y, en última instancia, la generación de in vitro modelos de cualquier enfermedad epitelial de cualquier paciente.

Un segundo beneficio clave fue la expansión indefinida similar a la de las células transformadas, pero sin las anomalías genéticas inherentes a las células cancerosas. Anteriormente, los organoides se generaban a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, o de células tumorales que por necesidad se modifican genéticamente ypor lo tanto, no representativo del paciente.

Bajo el desarrollo comercial de HUB, la tecnología organoide también proporciona estandarización y consistencia que es difícil de igualar, especialmente con cultivos de células primarias. Las biopsias del mismo paciente recolectan diferentes cantidades de células en etapas muy variables del ciclo de vida celular. Cuando se cultivan bajo protocolos HUB idénticosLas células progenitoras adultas dan lugar a organoides con exactamente las mismas células en las mismas proporciones, configuración física y genética, en todo momento, y con amplias capacidades de expansión.

Las celdas iniciales marcan la diferencia


Los cultivos de células en 3D se han desarrollado a partir de varias células, incluidas las líneas celulares transformadas y las células primarias. Los métodos de cultivo de células primarias convencionales se expanden solo durante varias generaciones, si es que lo hacen, lo que limita su idoneidad para biobancos o fabricación a gran escala. Además, el 3D convencionalLos métodos de cultivo de células primarias carecen de consistencia y adolecen de una mala fabricación, lo que confiere un carácter "único" a los estudios que los emplean. Además, los experimentos de análisis de expresión en cultivos de células primarias agregadas no son fiables, ya que el análisis debe realizarse dentro del plazo limitado antes de que el agregado pierdaintegridad. Solo los métodos que permiten una expansión estabilizada a largo plazo generan morfología y patrones de expresión asociados que han recuperado su in vivo características.

De manera similar, las células transformadas cultivadas en plástico han modificado su expresión génica para adaptarse a las condiciones de cultivo de tejidos. Estudios con dichas células puede ser útil , siempre que los investigadores reconozcan que la genética original del paciente no se ha conservado. En los organoides HUB se mantiene la huella molecular del paciente.

Un campo en el que esto ha sido particularmente útil son las enfermedades infecciosas. Los virus han evolucionado para infectar y replicarse en las células en sus estados fisiológicos normales. Por ejemplo, el virus respiratorio sincitial VSR crece fácilmente en los organoides, pero no infectará las células transformadas porque ellas células carecen de los receptores relevantes.

Los estudios celulares de enfermedades de las vías respiratorias, tópicos a la luz de la actual pandemia de COVID-19, se vieron obstaculizados durante años por esta razón, y no existía tecnología para expandir los cultivos de células primarias lo suficiente para estudios a gran escala. Al preservar las células críticasreceptores de superficie para agentes infecciosos, el método HUB permite el estudio de patógenos como RSV, virus del papiloma humano, norovirus, coronavirus, influenza, malaria y muchos otros.

Organoides en enfermedades infecciosas


Incluso antes de la pandemia de COVID-19, las infecciones del tracto respiratorio inferior se encontraban entre las principales causas de muerte en todo el mundo. Los modelos de roedores para la inmunidad de barrera humana son inadecuados y las funciones de barrera complejas que normalmente eliminan los virus de las vías respiratorias han sido difíciles de replicar in vitro , particularmente en células inmortalizadas.

Las células epiteliales son el primer punto de contacto para los microbios patógenos en el tracto respiratorio y, fortuitamente, los tipos de células que crecen más fácilmente como organoides. Los receptores en el epitelio de las vías respiratorias y las células alveolares detectan la infección, lo que inicia la inmunidad de la barrera mucosa a través de las células garrote, ciliadas, basales, células caliciformes y neuroendocrinas, que juntas eliminan los patógenos inhalados.

en un reciente ciencia papel , investigadores del Instituto Hubrecht y del Centro Médico Erasmus informaron sobre cómo los organoides intestinales los ayudaron a descubrir dos posibles vías para tratar o prevenir la infección por el SARS-CoV-2, el coronavirus responsable de la pandemia actual. El SARS-CoV-2 esSe sabe que infecta los pulmones, pero la evidencia clínica sugiere afectación intestinal tanto en la sintomatología como en la transmisión. Por ejemplo, los hisopos rectales contienen ARN viral durante un tiempo después de que los hisopos nasales indican que la infección se ha resuelto, lo que sugiere infección gastrointestinal y posiblemente transmisión fecal-oral.

Los enterocitos diferenciados expresan fuertemente el receptor 2 de la enzima convertidora de angiotensina ACE2 del SARS-CoV-2 a través del cual el virus ingresa a las células, con los niveles de receptor más altos en el borde en cepillo de los enterocitos intestinales. Sorprendentemente, el virus infectado tanto en niveles altos como bajosexpresores de ACE2, y la infectividad de los organoides no se vio muy afectada por las condiciones de cultivo.

El SARS-CoV-2 infectó rápidamente un subconjunto de células dentro del organoide y la infección aumentó con el tiempo. Usando microscopía electrónica para visualizar los componentes celulares, los investigadores encontraron partículas de virus dentro y fuera de las células constituyentes de los organoides. La infección indujo la liberación de interferón, un antiviral endógeno cuya activación podría servir como objetivo de posibles terapias.

Los investigadores concluyeron que “el epitelio intestinal apoya la replicación del SARS-CoV-2”, que los organoides del intestino delgado humano “sirven como modelo experimental para la infección y la biología del coronavirus” y “que los organoides humanos representan modelos experimentales fieles para estudiar la biología decoronavirus."

Además de los estudios de toxicología y detección de drogas, se han utilizado organoides de las vías respiratorias para estudiar la biología básica de las enfermedades infecciosas. En un nota de aplicación , los científicos de Corning informaron que la matriz extracelular de Corning® Matrigel® facilitó la expansión de las células epiteliales bronquiales derivadas del paciente en organoides de las vías respiratorias adecuados para análisis de alto rendimiento. Los organoides simplificaron el protocolo habitual de preparación de muestras en una sola operación, lisis celular, eliminando lo normalpasos de amplificación de genes, conversión de ADNc y preparación de bibliotecas.

Al comparar los organoides de las vías respiratorias normales y asmáticos, los investigadores observaron una mayor expresión de genes que codifican para quimiocinas proinflamatorias, receptores y otras proteínas asociadas con la inflamación en las células de las vías respiratorias asmáticas. También encontraron que los genes regulados al alza en los organoides derivados de células sanas eran losmismos que los regulados a la baja en los organoides de las células asmáticas, y viceversa. La aplicación del esteroide antiinflamatorio dexametasona indujo una regulación al alza o a la baja en un grado mayor en los organoides asmáticos en comparación con los organoides normales.

El estudio de Corning ilustra la versatilidad de los organoides para estudiar enfermedades de las vías respiratorias en presencia de comorbilidades, así como la capacidad de responder rápidamente con modelos adecuados para enfermedades infecciosas.

El futuro de los organoides en enfermedades infecciosas


en a entrevista reciente Evan Snyder, MD, Ph.D., director del Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa de Sanford Burnham Prebys, describió el papel potencial de los organoides de las vías respiratorias para estudiar la historia natural de la infección por COVID-19, incluida la forma en que se mueve el virusde una célula a otra, y potencialmente la capacidad de predecir los resultados de los pacientes individuales. "Podemos usar este modelo para determinar por qué a algunas personas les va peor que a otras", dijo Snyder. "Podemos comparar organoides creados a partir de hombres y mujeres; jóvenes o mayorespersonas; personas expuestas a diversas toxinas ambientales por fumar o vapear; personas con diabetes, enfermedades cardíacas o renales; e incluso personas de diferentes orígenes raciales o individuos que tienen variaciones genéticas que afectan su capacidad para combatir infecciones. Si averiguamos por qué el virusafecta a algunas personas de manera diferente, potencialmente podemos crear tratamientos personalizados ".

Los organoides HUB derivados de células madre adultas recolectadas de pacientes con fibrosis quística han demostrado ser valiosos en el estudio de patología de la FQ y han permitido pruebas de drogas centradas en el paciente, que fue el primer uso de los organoides HUB en la medicina personalizada. Los organoides derivados de pacientes con FQ se prueban para identificar tratamientos farmacológicos para pacientes con FQ y se tratan en consecuencia.

Estudios recientes sobre los receptores de interleucina-17 en el epitelio pulmonar han descubierto un papel de esta citocina en la inflamación aguda y crónica, y han demostrado que los receptores de IL-17 participan en la defensa inmune innata contra las infecciones pulmonares por hongos. in vivo , la expresión de IL-17 y la función inmune requieren células epiteliales polarizadas. En a papel que aparece en 2019 en Fronteras en inmunología , un grupo de la Universidad de Perugia, en Italia, escribió que debido a que los organoides pulmonares recapitulan la polaridad tisular, “brindan una emocionante posibilidad de usar organoides pulmonares para investigar exhaustivamente la señalización de IL-17R en el pulmón”, que es “probableofrecen nuevas oportunidades para desarrollar y probar terapias para enfermedades inflamatorias e identificar nuevos objetivos moleculares para mejorar la resistencia a las infecciones ”.

Como disciplina científica, los organoides continuarán evolucionando hacia una mayor facilidad de uso, consistencia, capacidades de paralelismo de ensayo y capacidad de fabricación. Los organoides y el órgano en un chip ya se han combinado en a modelo de retina complejo de múltiples tejidos , mientras que los sistemas que consisten en organoides de dos o más órganos, discutidos anteriormente, ya se usan de manera rutinaria.

Si la investigación sobre organoides continúa al ritmo actual, hay motivos para esperar una simplificación significativa del desarrollo de fármacos en la etapa inicial, específicamente en las etapas preclínica y de fase 1. Los organoides podrían eliminar algunas, si no todas, las pruebas en animales, pero esto requerirá un salto defe por parte de los reguladores que ya están acostumbrados a revisar los datos de animales y sus advertencias inherentes. En algún momento, los organoides podrían eliminar por completo las pantallas preclínicas "en vivo", lo que permitiría a los desarrolladores de medicamentos reclutar pacientes directamente en la fase 2 basándose completamente en pruebas de detección basadas en organoides.

Si bien las investigaciones con organoides conducen inevitablemente a sistemas de mayor complejidad, los investigadores deben tener en cuenta que la validación es la clave para los modelos relevantes para el paciente. Los organoides HUB por primera vez permiten a los investigadores desarrollar un modelo y probar directamente si se parece al paciente y cómo lo hace.de donde se originó el tejido. Con una complejidad creciente, el paso de validación debe seguir siendo un foco de los desarrolladores y usuarios del modelo. La complejidad es buena, pero solo hasta cierto punto.

El avance de los organoides hacia estos elevados objetivos, incluida una mayor capacidad de fabricación, requerirá herramientas de cultivo celular a la altura de la tarea. Las colaboraciones de la industria aseguran que las herramientas para el cultivo celular en 3D continuarán avanzando, tanto para la investigación general como para enfrentar los desafíos de las enfermedades infecciosas emergentes..

Autores:
Dr. Robert Vries, director ejecutivo de Hubrecht Organoid Technology HUB
Elizabeth Abraham, gerente sénior de productos, Corning Incorporated
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