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Técnicas clave en el control de calidad de la terapia celular

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Técnicas clave en el control de calidad de la terapia celular

Se persigue el desarrollo de terapias celulares con la esperanza de tratar una amplia gama de afecciones y enfermedades intratables. Se necesitan técnicas y protocolos de control de calidad CC para respaldar el desarrollo de inmunoterapias y medicina regenerativa. Desarrollar estándares regulatorios adecuados para laEl control de calidad de los productos de terapia basada en células es esencial para la protección de los pacientes que reciben dichos tratamientos y la protección de la industria. Por ejemplo, las "clínicas de células madre" sin licencia y autodenominadas han infligido efectos adversos graves a los pacientes; se informó de un casodonde los pacientes tenían la impresión de que estaban participando en un ensayo clínico, pero que se les pagaba para recibir inyecciones intravítreas bilaterales que producían pérdida de la visión. 1 Estos casos también pueden dañar la reputación de la investigación legítima con células madre.

Al igual que se utiliza un enfoque personalizado para tratar a los pacientes, es probable que no exista un conjunto de procedimientos "único para todos" para evaluar el control de calidad en la fabricación de terapias celulares.

Alentar a la industria a llegar a un acuerdo sobre lo que significa "calidad"
la Alianza Global para Terapias de iPSC células madre pluripotentes inducidas GAiT encuestó a los miembros sobre cómo entendían los atributos de calidad críticos en el contexto de las líneas de iPSC de grado clínico como material de partida para el desarrollo terapéutico alogénico. Estos son los atributos de calidad críticos paraiPSCs : 2

Identidad genotipo y fenotipo auténticos como se describió originalmente

Esterilidad microbiológica micoplasmas, bacteriología y pruebas virales

endotoxina

fidelidad y estabilidad genética

viabilidad

Caracterización

potencia

Las opiniones varían sobre los parámetros, ensayos y estándares exactos que deben aplicarse para evaluar la lista anterior, pero los expertos están de acuerdo en una cosa: la estrategia general de control de calidad no solo debe basarse en las pruebas del producto terminado. En su lugar, debe abarcar el entero proceso de fabricación.

En esta lista, exploramos algunas de las últimas técnicas clave en el control de calidad de la terapia celular que tienen como objetivo abordar los atributos anteriores.

1 Pruebas para evaluar el material de partida


La seguridad y eficacia de los productos de terapia celular depende en gran medida de la calidad del material de partida del que se derivan. Idealmente, habría un "criterio" aceptado internacionalmente para lo que constituye una línea de iPSC de "grado clínico". Para lograr esto, la industria debe acordar atributos de calidad críticos que tengan en cuenta muchos factores, incluida la identidad, la estabilidad, la viabilidad, la potencia y la esterilidad. Es probable que estos complementen los ensayos estándar existentes asociados con los bancos de células maestras. Ejemplos de ensayos de control de calidad para el material de partidaincluir:

análisis de cariotipo


El análisis de cariotipo o "cariotipo" es el proceso de emparejar y ordenar todos los cromosomas y se utiliza para evaluar si las células madre pluripotentes han acumulado mutaciones impulsadas por el cultivo. Se pueden observar cambios genéticos importantes, así como cambios más sutiles, incluidas deleciones,duplicaciones, traslocaciones o inversiones. 3

Pruebas de pluripotencia


¿Cómo podemos estar seguros de que las iPSC son de hecho pluripotentes? Las células madre pluripotentes se definen por su capacidad para diferenciarse en células de cualquiera de las tres capas germinales, por lo que realizar esta prueba de diferenciación es un enfoque. Los marcadores de pluripotencia se pueden utilizar parapredecir células con "pluripotencia funcional", para su uso en citometría de flujo e inmunohistoquímica. Se necesitan plantillas de análisis validadas para la citometría de flujo, ya que los marcadores de umbral de flujo implican cierta subjetividad. 2,4

análisis de repetición en tándem corto


El genotipado de células con repetición corta en tándem STR se utiliza para evaluar segmentos repetidos específicos de ADN que suelen tener de dos a seis pares de bases de longitud, llamado
STR . El genotipado de STR puede usarse para discriminar entre perfiles de ADN y en la autenticación rutinaria de células y tejidos. Debe ser realizado por un laboratorio acreditado utilizando un kit disponible comercialmente. 2

2 transcriptómica unicelular


La secuenciación de próxima generación NGS ha avanzado drásticamente nuestra comprensión de las diferentes patologías y el riesgo de enfermedades, al tiempo que permite nuevas capacidades de diagnóstico. Sin embargo, como el análisis de transcriptomas en profundidad requiere la elaboración de perfiles de un gran número de células, la secuenciación de poblaciones masiva convencional soloproporciona la señal de expresión promedio para un grupo de células. 5 Dado que las células de un tejido en particular no son necesariamente homogéneas, es posible que se pierda una importante variabilidad de célula a célula.

La transcriptómica unicelular está aquí para cambiar eso, y lo está
visto para ser una de las tecnologías emergentes más prometedoras para el control de calidad de la terapia celular. Una de las principales prioridades de la industria de la terapia celular es identificar los genes y las vías que definen las diferencias en los estados celulares, y la transcriptómica unicelular podría ayudar a lograrlo mediantepermitiendo a los investigadores : 5,6

Identificar paneles de marcadores para monitoreo y control celular durante la fabricación

Seguimiento de las trayectorias de distintos linajes celulares en desarrollo

Descubrir relaciones reguladoras entre genes

Clasifique celdas y estudie su agrupación

Identificar poblaciones de células raras

Los protocolos de secuenciación de ARN de una sola célula sc-RNA-seq permiten caracterizar el perfil transcripcional de miles de células individuales a la vez 7 así como estudios de metilación del ADN 8 modificación de histonas 9 y accesibilidad a la cromatina. 9 las tecnologías scRNA-seq difieren en la forma en que las células se separan y etiquetan, pero todas suelen trabajar en el mismo proceso general; las células se aíslan, se lisan y el ARN se transcribe de forma inversa en ADNc utilizando nanopartículas con códigos de barras únicos. Después de la síntesis de la segunda cadena,El ADNc se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa y luego se secuencia mediante NGS. 5 Al rastrear las nanopartículas con códigos de barras únicos, los investigadores pueden realizar un seguimiento de qué transcripciones provienen de qué células.

3 software cuantitativo para analizar datos de imágenes de células en vivo


Las células madre pluripotentes son conocidas por su potencial para diferenciarse en diferentes tipos de células y sus muchas aplicaciones posibles en la medicina regenerativa. Las células madre pluripotentes, que incluyen iPSC y células madre embrionarias, varían en su tendencia a diferenciarse en linajes específicos. 10 Por lo tanto, se necesita un proceso de selección para garantizar que las células madre pluripotentes con alta pluripotencia sean las que se utilicen en la medicina regenerativa.

Idealmente, el proceso de selección sería económico, rápido y relativamente sencillo. Si bien es probable que se utilicen una serie de técnicas para identificar las células deseadas, una de las primeras paradas del tren de control de calidad podría ser la obtención de imágenes de células vivas.
avances importantes en microscopía celular , los científicos ahora pueden visualizar orgánulos, mapear el movimiento de los loci de los cromosomas y detectar las fuerzas mecánicas.

A pesar de las enormes capacidades que permiten las imágenes de células vivas, otro desafío es decidir cómo administrar y usar los datos generados. Desarrollar algoritmos que permitan a los científicos tomar decisiones confiables durante los procesos de control de calidad es una prioridad importante para el campo. Un artículo reciente en Informes científicos describe el desarrollo de un sistema de imágenes que permite la evaluación cuantitativa de los grados de reprogramación de células somáticas y diferenciación de células madre pluripotentes. 11 A través de la generación de un índice de “distribución de fase”, las células madre pluripotentes se pueden agrupar en colonias con alta o baja pluripotencia, de una manera no invasiva e imparcial.

4 Herramientas para evaluar la tumorigenicidad


Las células embrionarias humanas se han comparado con un "arma de doble filo"; los rasgos que les permiten autorrenovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales también las hacen tumorigénicas. 12 Cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes, las células madre embrionarias humanas forman tumores benignos de células germinales, conocidos como teratomas. 13 Aunque no son idénticas, las iPScs humanas también comparten sus rasgos tumorigénicos. 12 Este es un obstáculo de seguridad crítico, ya que las células madre pluripotentes indiferenciadas que persisten en el producto final podrían iniciar el desarrollo de tumores en pacientes trasplantados. 4 Otros factores como la transformación celular o la inestabilidad genómica también pueden contribuir a la tumorigenicidad.

Por lo tanto, se necesitan herramientas para evaluar el potencial tumorigénico de las terapias celulares. A pesar del creciente número de productos de terapia celular que ingresan a ensayos clínicos, actualmente no existe un consenso mundial sobre el mejor método para la evaluación de la tumorigenicidad. 14 A la luz de esto, el Instituto de Ciencias Ambientales y de Salud HESI, una institución sin fines de lucro estableció un comité para generar evidencia científica necesaria para llegar a un consenso sobre la estrategia para evaluar la tumorigenicidad CT-TRACS: Terapia Celular - Seguimiento,Circulación y Seguridad.

En 2019, el comité CT-TRACS publicó un documento de posición en citoterapia que destacó las limitaciones de los enfoques disponibles actualmente y las posibles direcciones futuras. 4 Notaron que :

Las pruebas de tumorigenicidad teóricamente se refieren a la detección de células residuales indiferenciadas o células transformadas en el producto final, las cuales se consideran "contaminantes" o "impurezas" para el producto final de terapia celular diferenciada

Debido a las complejidades de las terapias celulares, es probable que se desarrolle un conjunto de pruebas de tumorigenicidad caso por caso para productos celulares individuales

La tumorigenicidad celular es distinta de la oncogenicidad celular

tecnologías actualmente disponibles


pruebas in vivo

Varios modelos animales inmunodeprimidos brindan oportunidades para in vivo la evaluación de la tumorigenicidad, siempre que se demuestre con éxito el injerto y la supervivencia del producto celular trasplantado. 4 como in vitro pruebas, no existe un consenso global sobre los parámetros necesarios para demostrar que es poco probable que las células formen tumores.

in vitro
pruebas :

En la siguiente tabla se enumeran los métodos que se pueden utilizar para detectar diferentes aspectos de la tumorigenicidad : 4

métodos

usado para detectar

Citometría de flujo, RT-PCR cuantitativa, PCR digital de gotitas, cultivo altamente eficiente de células madre pluripotentes, detección de moléculas marcadoras liberadas en el medio de cultivo

células madre pluripotentes

ensayo de proliferación celular

células inmortalizadas

Ensayo digital de formación de colonias en agar blando

crecimiento celular independiente del anclaje

análisis de cariotipo, hibridación genómica comparativa de matrices, fluorescencia in situ hibridación, NGS

inestabilidad genómica

Tecnologías emergentes: Organ-on-a-chip


La tecnología Organ-on-a-chip podría usarse para simular el trasplante de tejido en células derivadas del paciente e identificar el desarrollo de tumores. 15 Aunque este enfoque se encuentra en las primeras etapas de desarrollo, varios estudios de prueba de concepto han demostrado su potencial.

5 Pruebas de esterilidad


A diferencia de algunos productos biofarmacéuticos, los productos de terapia celular no pueden someterse a un último paso de filtración estéril. Además, la vida útil limitada de los productos de terapia celular plantea un desafío adicional. Esto crea la necesidad de métodos microbianos rápidos para garantizar la eliminación de los contaminantes.durante el proceso de fabricación. Si bien existe una variedad de pruebas para identificar micoplasmas, bacterias y virus, la qPCR rápida es una que se muestra particularmente prometedora. El año pasado, la Administración de Alimentos y Medicamentos, Health Canada y elAgencia Europea de Medicamentos para uso en productos CAR-T en clínica
estudios. 16

El establecimiento de protocolos para el control de calidad de la terapia celular requiere que la industria llegue a un consenso sobre la estandarización de parámetros y análisis. Comprender las implicaciones de mutaciones específicas, número de pases y otros factores ayudará a guiar a la industria hacia las técnicas y parámetros de calidad más adecuados.

Referencias :

1. Kuriyan AE, Albini TA, Townsend JH, et al. Pérdida de la visión después de la inyección intravítrea de “células madre” autólogas para AMD. N Engl J Med . 2017; 376 11: 1047-1053. Doi : 10.1056 / NEJMoa1609583

2.
Sullivan S, Stacey GN, Akazawa C, et al. Directrices de control de calidad para líneas de células madre pluripotentes inducidas por humanos de grado clínico. Regen Med . 2018; 13 7: 859-866. Doi : 10.2217 / rme-2018-0095

3.
O'Connor, C. 2008 Cariotipo de anomalías cromosómicas. Educación sobre la naturaleza 1 1: 27

4. Sato Y, Bando H, Di Piazza M, et al. Evaluación de tumorigenicidad de productos de terapia celular: la necesidad de consenso global y puntos a considerar. citoterapia . 2019; 21 11: 1095-1111. Doi : 10.1016 / j.jcyt.2019.10.001

5. Hwang B, Lee JH, Bang D. Tecnologías de secuenciación de ARN unicelular y canalizaciones bioinformáticas. Exp Mol Med . 2018; 50 8: 1-14. Doi : 10.1038 / s12276-018-0071-8

6. Wagner A, Regev A, Yosef N. Revelando los vectores de identidad celular con genómica unicelular. Nat Biotechnol . 2016; 34 11: 1145-1160. Doi : 10.1038 / nbt.3711

7. AlJanahi AA, Danielsen M, Dunbar CE. Introducción al análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula. Desarrollo Clínico de Métodos Mol Ther . 2018; 10: 189-196. Doi : 10.1016 / j.omtm.2018.07.003

8. Karemaker ID, Vermeulen M. Perfiles de metilación de ADN de una sola célula: tecnologías y aplicaciones biológicas. Tendencias biotecnológicas . 2018; 36 9: 952-965. Doi : 10.1016 / j.tibtech.2018.04.002

9. Ku WL, Nakamura K, Gao W, et al. Secuenciación de inmunoescisión de cromatina unicelular scChIC-seq para perfilar la modificación de histonas. Métodos Nat . 2019; 16 4: 323-325. Doi : 10.1038 / s41592-019-0361-7

10. Osafune K, Caron L, Borowiak M, et al. Diferencias marcadas en la propensión a la diferenciación entre líneas de células madre embrionarias humanas. Nat Biotechnol . 2008; 26 3: 313-315. Doi : 10.1038 / nbt1383

11.
Nishimura K, Ishiwata H, Sakuragi Y, Hayashi Y, Fukuda A, Hisatake K. Imágenes de células vivas de estructuras subcelulares para la evaluación cuantitativa de células madre pluripotentes. Representante de ciencia . 2019; 9 1: 1777. Doi : 10.1038 / s41598-018-37779-x

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Ben-David U, Benvenisty N.La tumorigenicidad de las células madre pluripotentes inducidas y embrionarias humanas. Nat Rev Cáncer . 2011; 11 4: 268-277. Doi : 10.1038 / nrc3034

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14.
S de Wilde, Hj G, Ml Z, P M. Desarrollo clínico de terapias basadas en genes y células: descripción general del panorama europeo. Desarrollo Clínico de Métodos Mol Ther . 2016; 3: 16073-16073. Doi : 10.1038 / mtm.2016.73

15.
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16.
Dreolini L, Cullen M, Yung E, et al. Una técnica de amplificación de ácidos nucleicos rápida y sensible para la detección de micoplasmas de productos de terapia celular. Métodos de terapia molecular y desarrollo clínico . 2020; 17: 393—399. Doi : 10.1016 / j.omtm.2020.01.009

Conozca al autor
Michele Trott, PhD
Escritor científico
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