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Un mundo completamente nuevo de espectrometría de masas nativa

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Un mundo completamente nuevo de espectrometría de masas nativa

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Si se le pudiera conceder un deseo que le brindara toda una vida de purificación de proteínas sin problemas, cuantificación de unión exitosa y conocimientos increíbles para el análisis bioterapéutico, ¿cuál sería?

Un genio sabio podría alentarlo a desear la última tecnología en espectrometría de masas nativa MS nativa, para caracterizar directamente grandes complejos de proteínas con una resolución sin precedentes.

Dentro de la industria biofarmacéutica, las proteínas grandes no solo son los principales objetivos de los fármacos, sino que también se utilizan como fármacos en sí mismos, en forma de anticuerpos monoclonales, conjugados anticuerpo-fármaco y proteínas de fusión. La caracterización de las interacciones entre proteínas y otras moléculas es fundamentalpara comprender y modular la función de una proteína, guiando múltiples etapas del descubrimiento y desarrollo de fármacos. Debido a limitaciones técnicas, las proteínas generalmente se evalúan de forma aislada después de ser eliminadas de su entorno nativo. Sin embargo, como las proteínas llevan a cabo sus actividades biológicas en complejos, este enfoque reduccionista da como resultado la pérdida de información funcionalmente importante.

La EM nativa se ha convertido en una técnica poderosa en las últimas dos décadas y continúa evolucionando hasta convertirse en una herramienta sofisticada para el análisis de grandes complejos de proteínas. Ahora está comenzando a atraer una atención significativa de las compañías de descubrimiento de fármacos que desean explotar estas capacidades.artículo, compartimos cómo la tecnología MS nativa moderna ahora ofrece conocimientos biológicos más profundos y dinámicos y explicamos por qué las plataformas correspondientes son una opción digna para su "único deseo".

No es tan simple: reconocer la dinámica y la diversidad es clave para el análisis de proteínas


Las técnicas clásicas de biología estructural, como la cristalografía de rayos X o la microscopía electrónica criogénica, proporcionan información sobre los aspectos de unión y / o estructurales / funcionales de una proteína. Al juntar las estructuras de rayos X, los investigadores han logrado una mejor comprensión de la biologíala señalización de la proteína circundante. Si bien estas técnicas están mejorando, los métodos utilizados para lograr imágenes de alta resolución oscurecen la heterogeneidad estructural en las muestras y no brindan la imagen completa.

Las proteínas regulan una amplia gama de sistemas biológicos críticos formando interacciones transitorias y estables con otras biomoléculas. Por ejemplo, una proteína podría participar en una breve interacción durante una cascada de señalización o formar un componente clave de una máquina molecular de múltiples subunidades.Estos ensamblajes de proteínas son complejos y cambian su forma y capacidad de unión cuando se exponen a diferentes condiciones físicas, como el pH y la temperatura. Para capturar datos que reflejen la verdadera función y el estado de una proteína, los complejos de proteínas idealmente se caracterizarían mientras se conservan en su forma plegada y unida.Como veremos más adelante en este artículo, este es un desafío particular para el análisis de proteínas de membrana, que constituyen la familia más grande de dianas de fármacos.

Las interacciones entre proteínas y moléculas pequeñas son aspectos importantes a considerar al dilucidar la función de las proteínas, pero la recopilación de información relacionada con la unión proteína-ligando es desafiante y compleja. Con los enfoques tradicionales de la biología estructural, a menudo se encuentran importantes detalles de alta definición sobre la unión proteína-ligandoperdido, como :
  • las interacciones pueden ser transitorias y dinámicas
  • Descifrando la identidad química exacta de los lípidos , los metabolitos y cofactores en contacto con la proteína es difícil
  • Los polipéptidos a menudo experimentan modificaciones covalentes que alteran la función modificación postraduccional, lo que crea una complejidad adicional


Las modificaciones covalentes pueden afectar significativamente la función de las proteínas. Sin embargo, estas modificaciones generalmente se minimizan o eliminan durante los análisis estructurales. Aunque los métodos lipidómicos y metabolómicos se pueden usar para identificar las moléculas pequeñas que se unen a proteínas, estos métodos a menudo requieren conocimientos previos de la química del ligando y puedenImplican el cribado a gran escala o la extracción química. Tales intervenciones rompen el vínculo entre los socios de unión no covalentes y la proteína / complejo, lo que requiere la confirmación posterior de los ligandos inferidos que se lograrán mediante la incubación con la proteína / complejo original y el ligando inferido. A pesar de los avances enestas técnicas, las estructuras químicas del ligando a menudo permanecen sin identificar.

Recientemente, se han desarrollado métodos nativos de EM para superar estos desafíos y limitaciones. Desentrañar la identidad química de un socio de unión de ligando de una proteína / complejo, es decir, identificar más que solo su masa, es ahora un objetivo alcanzable. Esto es posible gracias anueva tecnología de instrumentación de EM, que permite la observación y el aislamiento del complejo intacto ligando-proteína unido no covalentemente, la separación disociación del ligando de la proteína / complejo, seguida del aislamiento y fragmentación del ligando liberado para la elucidación / identificación estructural, todo en unoexperimento compuesto. Esto tiene poderosas implicaciones para muchas ramas de la biología en la academia y la industria.

Pharma preparada para cosechar las recompensas de los avances en espectrometría de masas nativa


adentro proteómica ascendente , las proteínas se digieren en péptidos y, por lo general, se separan mediante cromatografía líquida antes de enviarse al espectrómetro de masas. Durante la preparación de la muestra, la proteína se desnaturaliza, lo que conduce a la pérdida de interacciones no covalentes. Por el contrario, en la EM nativa, no haydigestión o desnaturalización de proteínas, de modo que se conservan la integridad estructural de la proteína y las asociaciones no covalentes, y los complejos de proteínas intactos se envían al espectrómetro de masas. Esto permite la observación directa de todo el complejo, proporcionando alta resolución y detalles precisos sobre la composición y estequiometría deel complejo, así como ligandos endógenos unidos o compuestos sintéticos.

Estudiar proteínas en su estado nativo puede proporcionar conocimientos biológicos más profundos que antes se consideraban fuera de alcance cuando se trabaja con métodos tradicionales de biología estructural, como la caracterización en profundidad de nuevos interacciones fármaco-proteína y ribosomal partículas. Como se muestra en la Figura 1, la tecnología MS nativa moderna ahora proporciona una forma de recopilar datos completos de grandes complejos de proteínas.

Figura 1. Recopilación de datos completos de grandes complejos de proteínas utilizando tecnología MS nativa.

La EM nativa se utiliza cada vez más en la investigación académica y en la industria biofarmacéutica en múltiples etapas del desarrollo de fármacos. Esto no es sorprendente, en parte porque los instrumentos de EM de masa precisa HRAM de alta resolución, respaldados por software que facilita la interpretación de datos, se han convertido enmás accesible y fácil de usar. Durante el análisis bioterapéutico, los protocolos de purificación deben evaluarse y optimizarse para garantizar que las proteínas se produzcan con un rendimiento y pureza adecuados. La MS nativa es ideal para facilitar esta evaluación, ya que puede proporcionar información relacionada con las variantes e impurezas resultantesa partir de diferentes condiciones de cultivo celular, expresión génica u otras condiciones de desarrollo. Por ejemplo, la identificación de lípidos, variantes de secuencia truncada y homogeneidad y estequiometría de proteínas puede ayudar a guiar la purificación y permitir a los investigadores mejorar sus procesos. Esta información también puede revelar cómo conservar proteínascomplejos en su estado funcional.

Los datos cuantitativos sobre la unión de ligandos son extremadamente valiosos durante los estudios de selección de líderes de fármacos, donde la caracterización de las afinidades de unión de los ligandos a las proteínas puede guiar la selección de candidatos. En etapas posteriores del descubrimiento de fármacos, la EM nativa puede proporcionar una gran cantidad de datos valiosos para un rangode bioterapéuticos, incluyendo :
  • Anticuerpos terapéuticos: por ejemplo, integridad de secuencia, actividad de unión a antígeno, perfil de glucanos y caracterización de otras modificaciones postraduccionales
  • Conjugados anticuerpo-fármaco y anticuerpos biespecíficos: p. Ej., Relación fármaco-anticuerpo, composición e información del sitio de conjugación


La EM nativa abre las puertas a la investigación de proteínas de membrana


Las proteínas de membrana como los receptores acoplados a proteínas G GPCR, los transportadores y los canales iónicos cumplen una amplia gama de funciones biológicas y son muy valiosas en la industria farmacéutica, ya que representan más del 50% de los objetivos farmacológicos actuales. Sin embargo,con sus bajos niveles de expresión y tendencia a perder la integridad estructural fuera del entorno de la membrana celular lipídica, el análisis biofísico de las proteínas de la membrana es particularmente desafiante. Para respaldar su integridad estructural fuera de la membrana, estas proteínas se formulan en entornos lipofílicos. Por lo general, estoocurriría en las micelas de detergente, pero las proteínas también se pueden formular en nanodiscos, anfíolos, copolímeros o bicelas.

Si bien el uso de detergentes y otros estabilizadores mejoran la integridad estructural de la proteína, crean desafíos adicionales en muchas técnicas biofísicas. En la EM nativa, este desafío se supera activando vibracionalmente el complejo de proteomicelas mientras está dentro del espectrómetro de masas y liberandola proteína del detergente. Con este enfoque, se pueden obtener mediciones de masa de alta resolución para dilucidar la estequiometría de la proteína de la membrana y las interacciones de unión del ligando.

Recientemente, la EM nativa ha proporcionado conocimientos únicos al capturar e interrogar ligandos endógenos dentro del entorno del ensamblaje de proteínas intactas. En un estudio de Gault et al. , utilizando tecnología de EM nativa desarrollada por OMass Therapeutics, empresa derivada de la Universidad de Oxford en estrecha colaboración con científicos del laboratorio Carol V. Robinsons en la Universidad de Oxford, se descubrieron reguladores potenciales de la función de las proteínas y se desentrañaron una serie de características moleculares de ligandos unidosAdemás de la homogeneidad y la confirmación de las proteínas, se recopilaron la identificación de la clase de lípidos, la longitud de la cadena, el grado de saturación y la estructura del péptido y la unión terapéutica para caracterizar finalmente el lipidoma / metaboloma funcional en contacto con las porinas de la membrana y un translocador mitocondrial.se logra utilizando un "enfoque de la ómica nativa", que unifica la EM nativa con los análisis "ómicos". Estas interacciones suelen ser difíciles de definir utilizando solo información estructural de alta resolución, destacando la EM nativa como una herramienta poderosa y complementaria para la investigación de proteínas de membrana.

El "enfoque nativeomics" ha permitido un mayor conjunto de aplicaciones para la EM nativa; se puede utilizar para definir la densidad de electrones desconocidos en mapas de proteínas de membrana de alta resolución y para descubrir la identidad de metabolitos clave, ligandos y cofactores asociados con la proteína de membranatransportadores y receptores. Al estudiar los GPCR, la capacidad de visualizar y caracterizar la activación de proteínas permite a los investigadores al mismo tiempo :
  • Identifique la proteína reclutada para transmitir la señal
  • cuantifique la fuerza de la unión del compuesto
  • aclarar las consecuencias de la unión del ligando


Mientras que otros métodos brindan información sobre la unión o la función, la EM nativa combina ambos aspectos en una herramienta "biofísica" de alta resolución.

No hay señales de que el desarrollo de MS nativa se ralentice


De cara al futuro, los usuarios nativos de EM tienen la vista puesta en algunos objetivos futuros, ya que aquellos que buscan nuevos conocimientos biológicos siempre agradecerán un análisis más extenso de los ligandos co-purificadores. Un mayor desarrollo de la lectura de unión y función de los GPCR es claveprioridad, que podría extenderse a otras proteínas de interés.

La capacidad de analizar proteínas / complejos directamente de entornos celulares mediante EM nativa sería el objetivo analítico final para el campo. A medida que se avanza hacia ese ambicioso objetivo, existe un conjunto de avances técnicos y tecnológicos más pequeños que podrían integrarse cony se utiliza para análisis nativos basados ​​en MS, como capacidades de manejo de líquidos más automatizadas y software analítico mejorado que permite agilizar el análisis de complejos. En conjunto, los científicos continuarán abordando los cuellos de botella en todo el protocolo analítico general, desde la extracción y preparación de muestras hasta el procesamiento de datos yinterpretación.

Concediendo un simple deseo: analizar grandes complejos de proteínas con confianza


Durante mucho tiempo, la obtención de información sobre muchas características moleculares e interacciones entre proteínas y ligandos endógenos permaneció algo fuera de su alcance. Sin embargo, se han realizado esfuerzos significativos para avanzar en las técnicas de EM nativa para superar las limitaciones anteriores del análisis de complejos de proteínas. EM nativa modernaLa tecnología puede beneficiar la investigación biofarmacéutica y el descubrimiento de fármacos al proporcionar una vista enriquecida y de alta resolución de los sistemas biológicos, que se puede seguir con otras técnicas complementarias de biología estructural, si es necesario.

Los datos de alta resolución relacionados con las interacciones proteína-ligando de la membrana ahora se pueden obtener fácilmente para determinar las vías fisiológicas mediadas por las interacciones respectivas, lo que brinda una mejor oportunidad de encontrar candidatos a fármacos exitosos. La EM nativa continúa avanzando, proporcionando valor en el contexto depurificación de proteínas, cuantificación de la unión y caracterización bioterapéutica, y se erige como una opción digna en caso de que encuentre un genio en su laboratorio analítico, o simplemente esté abierto a una actualización de EM.

Autores del artículo:

Dra. Krisztina Radi, directora de marketing vertical farmacéutica y biofarmacéutica, cromatografía y espectrometría de masas, Thermo Fisher Scientific

Dr. Ali Jazayeri, director científico de OMass Therapeutics

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