Hemos actualizado nuestro Política de privacidad para aclarar cómo usamos sus datos personales.

Usamos cookies para brindarle una mejor experiencia. Puede leer nuestro Política de cookies aquí.

Publicidad
lista

Aplicaciones de secuenciación de una sola celda

lista

Aplicaciones de secuenciación de una sola celda

En los últimos años, la secuenciación unicelular se ha convertido en un método de uso omnipresente en diferentes áreas de la investigación biológica. ¿Por qué tantos investigadores, tanto del mundo académico como de la biotecnología, han adoptado tan rápidamente este conjunto relativamente novedoso de técnicas? Secuenciación unicelular,o genómica unicelular, aborda las advertencias clave de los enfoques de secuenciación de tejidos a granel para permitir lecturas moleculares de resolución celular sin la necesidad de purificar o enriquecer tipos celulares específicos. Antes de la adopción generalizada de la genómica unicelular, la secuenciación de ARN o ADN se realizaba mediante el aislamiento ysecuenciar los ácidos nucleicos de un fragmento de tejido. Dado que los tejidos y órganos están compuestos por múltiples tipos de células de diversidad molecular, la obtención de información sobre la abundancia de ARN o la variación de la secuencia de ADN de un conjunto de células enmascara la verdadera heterogeneidad de los tipos de células. Este es un desafío crucial enresponder a preguntas de ciencia básica y traslacional, ya que cada vez entendemos más que las funciones y trastornos corporales normalesLos procesos de facilidad dependen en gran medida de una interacción orquestada de tipos de células específicos con roles definidos.Estas funciones específicas del tipo de célula, en su orden, hacen uso de diversas redes reguladoras de genes y perfiles de expresión génica en cada tipo de célula.La genómica unicelular desentraña esta diversidad molecular una célula a la vez de manera imparcial.

En esta lista, discutimos los tipos de enfoques de secuenciación unicelular, la tecnología detrás de ellos y hablaremos sobre cómo la aplicación de estas técnicas a preguntas en varios campos de la ciencia biomédica ha llevado a nuevos conocimientos biológicos.

secuenciación de ARN unicelular


Las técnicas de secuenciación de células individuales mejoran constantemente y se han adoptado para analizar una variedad de características moleculares de células individuales. La secuenciación de ARN fue una de las primeras técnicas que se aplicó a células individuales de un tejido u órgano. Secuenciación de ARN de células individualesscRNA-seq captura células individuales en micropocillos o microgotas y utiliza la transcripción inversa RT junto con cebadores de ADN RT con código de barras para convertir moléculas de ARN dentro de cada célula individual en ADN complementario ADNc con código de barras. La transcripción inversa es seguida por la reacción en cadena de la polimerasapara amplificar el ADN resultante, que luego se secuencia mediante secuenciación de próxima generación. Dado que todas las moléculas de ADNc que se originan en la misma célula comparten un código de barras de ADN también llamado código de barras de la célula, al analizar los datos de secuenciación de un experimento de scRNA-seq, se puede estimarla identidad y abundancia de cada transcripción de ARN a nivel de una célula individual. Una vez que se conocen las abundancias de transcripciones de ARN en cada célula, estos ARN seLos perfiles de expresión se pueden utilizar para identificar tipos de células de manera no sesgada agrupando células con perfiles similares.Este enfoque permite la identificación de perfiles de expresión génica para todos los tipos de células en el tejido.Estos incluyen tipos de células raras o tipos de células que son difíciles de purificar del tejido utilizando otras técnicas, como la clasificación de células.Además, al usar perfiles de expresión de ARN e información sobre la pertenencia a tipos de células, se puede usar scRNA-seq para determinar los cambios en la expresión génica que tienen lugar en cada tipo de célula por separado en una condición específica, como en una enfermedad.

scRNA-seq se ha aplicado con éxito a una multitud de cuestiones en las ciencias biológicas. Una de las más fructíferas fue su aplicación a la neurociencia debido a la gran cantidad de tipos de células en el cerebro de los mamíferos y los desafíos de purificarlos y estudiarlos utilizandotécnicas convencionales. scRNA-seq se ha utilizado para crear atlas del cerebro humano en desarrollo a la resolución de una sola célula, creando un recurso poderoso para comprender cómo se desarrolla un sistema nervioso central humano normal y cómo se perturba la diferenciación y maduración de tipos celulares específicos enenfermedades del neurodesarrollo.

Además, una variación de scRNA-seq, denominada secuenciación de RNA de un solo núcleo snRNA-seq, permitió recientemente a los investigadores identificar los tipos de células y sus firmas moleculares en cerebros maduros de humanos y ratones.-mortem de tejido cerebral o de tipos de células que son difíciles de aislar, como las neuronas maduras, mediante la secuenciación del ARN de núcleos unicelulares. 1 Comprender la composición del tipo celular del cerebro humano adulto allana aún más el camino para desarrollar terapias celulares y farmacológicas dirigidas para las enfermedades que lo afectan, como lesiones cerebrales y enfermedades neurodegenerativas.

Además, snRNA-seq se ha aplicado para estudiar directamente la enfermedad del cerebro humano mediante el perfil del tejido cerebral normal y el tejido cerebral de pacientes afectados por un trastorno neurológico. Como tal, el estudio snRNA-seq del trastorno del espectro autista TEA descubrió que unsubtipo de neuronas en la corteza cerebral humana cambia drásticamente en esta enfermedad. 2 En otro estudio, snRNA-seq se ha utilizado para identificar cómo responden y cambian tipos específicos de células neuronales y gliales en las lesiones de esclerosis múltiple.
3

secuenciación unicelular para perfiles epigenéticos


La epigenética es un campo en rápida evolución que se centra en el estudio de los mecanismos reguladores de genes que controlan la expresión génica mediante la alteración del estado de la cromatina, el complejo ADN-proteína que sirve para empaquetar el ADN en la célula. La cromatina existe en dos estados principales: eucromatina tambiéndenominada cromatina abierta y heterocromatina. Los genes de las regiones de cromatina abierta generalmente son transcripcionalmente activos, mientras que los de las regiones de heterocromatina están silenciados. Además del estado de la cromatina, la expresión génica está regulada directamente por modificaciones químicas del ADN, más comúnmente a través de la metilación de la citosinabases. La metilación del ADN que engloba un gen generalmente conduce al silenciamiento del gen. Los avances en el campo de la epigenética han sugerido cada vez más que la metilación del ADN y los perfiles cromáticos son altamente específicos de tejido y tipo celular. Afortunadamente, los avances recientes en la genómica unicelular hanproporcionó a los científicos formas de analizar los estados epigenéticos de células individuales mediante la realización de cell Ensayo de cromatina accesible por transposasa seguido de secuenciación scATAC-seq, que revela regiones de cromatina abierta, así como análisis de metilación de ADN de una sola célula.

scATAC-seq ya ha demostrado ser fundamental para comprender cómo se desarrollan los tipos de células específicas en varios tejidos y cómo estos programas de desarrollo se vuelven rebeldes en la enfermedad. Esta técnica se ha utilizado para comprender cómo las firmas epigenéticas de las células madre, los tipos de células neuronales y gliales enel cerebro humano en desarrollo 4 y la retina del ratón cambia a medida que las células se diferencian y maduran. 5 En un esfuerzo por comprender la patogénesis de la enfermedad, scATAC-seq identificó un programa epigenético mantenido por las células T de memoria en la diabetes tipo 1 y median la reactividad autoinmune. 6 Además, scATAC-seq se ha utilizado para comprender mejor el papel de la regulación epigenética en la patogénesis de varios cánceres, incluido el cáncer de mama triple negativo 7 y leucemia aguda. 8

secuenciación unicelular para inmunología


El sistema inmunológico adaptativo se basa en la capacidad de los clones de células T y B para producir receptores de células T TCR y anticuerpos que pueden unirse a un enorme repertorio de antígenos. Esta increíble diversidad se desarrolla a través de la reordenación aleatoria y la hipermutación de genes que codifican TCRy cadenas de anticuerpos seguidas de la selección de linfocitos T y B para eliminar las células que reaccionan a los autoantígenos en el cuerpo. Este proceso genera una diversidad estimada de 10 15 -10 20 para TCR y 3 × 10 11 para anticuerpos. Cada clon de células T o B expresa un TCR o anticuerpo único, y tras la reacción a un antígeno extraño como de una bacteria, un virus o una célula cancerosa, este clon sufre una gran cantidad de divisiones celulares.La secuencia de nucleótidos de un TCR o una cadena de anticuerpos se puede usar para producir más células T y anticuerpos con fines terapéuticos, o incluso para predecir el antígeno diana, comprender esta secuencia es un desafío crucial en inmunología. Debido a la naturaleza clonal del TCR y el anticuerpodiversidad, un enfoque unicelular es el más adecuado para comprender los mecanismos en juego.

El perfil de células B unicelulares se ha aplicado recientemente para identificar anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 mediante la secuenciación de clones individuales de células B que producen el anticuerpo en pacientes con COVID-19. 9 Este nuevo hallazgo altamente alentador resalta el poder del perfil inmune unicelular para convertirse en un importante impulsor del descubrimiento de anticuerpos terapéuticos para enfermedades infecciosas. Dada la enorme importancia del sistema inmunológico en la tumorigénesis y la metástasis, otra aplicación altamente prometedora de inmunogénesis unicelularla elaboración de perfiles es la biología del cáncer. Recientemente, esta técnica también se ha utilizado para comprender la importancia pronóstica de los TCR específicos en pacientes con carcinoma de células renales, así como la heterogeneidad de las células T en
sarcoma pediátrico. Nicole Velmeshev, profesora asistente de la Universidad Estatal de San Francisco, sostiene que el perfil inmunitario unicelular presenta una gran promesa en el desarrollo de nuevos tratamientos para varios tipos de cáncer. Dado que la supresión de la reactividad inmunitaria es uno de los mecanismos clavepor el cual las células cancerosas evaden las defensas del huésped y teniendo en cuenta el inmenso éxito de la terapia inmunológica en muchos tipos de cáncer, la capacidad de comprender qué receptores o anticuerpos de células T exactos se dirigen a las células cancerosas es crucial, dice la Dra. Velmeshev. Según ella, una vez quePodemos obtener esta información rápidamente para cada paciente de cáncer individual y para cada tumor, podremos desarrollar terapias dirigidas, como anticuerpos o células del receptor de antígeno quimérico T CAR-T, que son altamente efectivos para matar las células cancerosas del individuo específico..

Multi-ómicas y el futuro de la secuenciación unicelular


Más recientemente, las tecnologías de secuenciación unicelular han permitido a los investigadores obtener múltiples lecturas moleculares de la misma célula. Por ejemplo, la secuenciación conjunta de ARN unicelular y la secuenciación ATAC unicelular permiten la determinación simultánea de los perfiles transcripcional y epigenético decélulas individuales. Dado que los perfiles de expresión de ARN de los genes marcadores son muy informativos para determinar el tipo de célula, este ARN combinatorio y el perfil de cromatina abierto permiten la identificación de perfiles epigenéticos de tipos de células específicos de una manera no sesgada. Además, mediante el análisis de cambios en la transcripción y aperturaperfiles de cromatina dentro y entre tipos de células, se pueden sacar conclusiones sobre los efectos de la regulación epigenética sobre la expresión génica en diversas condiciones, como patología de enfermedades o diferenciación celular.

Además de los ácidos nucleicos, la secuenciación unicelular ahora permite cuantificar la abundancia de un conjunto predeterminado de proteínas a nivel unicelular utilizando anticuerpos con códigos de barras. Dado que los niveles de proteínas están más correlacionados con las funciones celulares y no siempre están en perfecto acuerdocon expresión de ARN debido a múltiples niveles de regulación postranscripcional, esta lectura es fundamental para analizar procesos celulares tan rápidos como la activación de células inmunes. Dado que la cuantificación de proteínas en células individuales se limita actualmente a decenas de proteínas a la vez, este enfoquese combina con la evaluación de todo el genoma de la expresión de ARN.

Referencias

  1. Lake BB, Ai R, Kaeser GE, et al. Subtipos neuronales y diversidad revelada por la secuenciación de ARN de un solo núcleo del cerebro humano. ciencia . 2016; 352 6293: 1586-1590. Doi : 10.1126 / science.aaf1204

  2. Velmeshev D, Schirmer L, Jung D, et al. La genómica unicelular identifica cambios moleculares específicos del tipo celular en el autismo. ciencia . 2019; 364 6441: 685-689. Doi : 10.1126 / science.aav8130

  3. Schirmer L, Velmeshev D, Holmqvist S, et al. Vulnerabilidad neuronal y diversidad multilinaje en la esclerosis múltiple. Naturaleza . 2019; 573 7772: 75-82. Doi : 10.1038 / s41586-019-1404-z

  4. Ziffra RS, Kim CN, Wilfert A, et al. Atlas epigenómico unicelular del cerebro humano en desarrollo y organoides. bioRxiv . Publicado en línea el 8 de enero de 2020: 2019.12.30.891549. Doi : 10.1101 / 2019.12.30.891549

  5. Norrie JL, Lupo MS, Xu B, et al. Dinámica de nucleomas durante el desarrollo de la retina. neurona . 2019; 104 3: 512-528.e11. Doi : 10.1016 / j.neuron.2019.08.002

  6. Abdelsamed HA, Zebley CC, Nguyen H, et al. Las células T CD8 + específicas de las células beta mantienen los programas epigenéticos asociados a la memoria de las células madre durante la diabetes tipo 1. Nat Immunol . 2020; 21 5: 578-587. Doi : 10.1038 / s41590-020-0633-5

  7. Shu S, Wu HJ, Ge JY, et al. Interacciones sintéticas letales y de resistencia con inhibidores de bromodominio BET en cáncer de mama triple negativo. célula molecular . 2020; 78 6: 1096-1113.e8. Doi : 10.1016 / j.molcel.2020.04.027

  8. Granja JM, Klemm S, McGinnis LM, et al. El análisis multiómico unicelular identifica programas reguladores en la leucemia aguda de fenotipo mixto. Nat Biotechnol . 2019; 37 12: 1458-1465. Doi : 10.1038 / s41587-019-0332-7

  9. Cao Y, Su B, Guo X, et al. Anticuerpos neutralizantes potentes contra el SARS-CoV-2 identificados mediante secuenciación unicelular de alto rendimiento de células B de pacientes convalecientes. celda . 2020; 182 1: 73-84.e16. Doi : 10.1016 / j.cell.2020.05.025
Publicidad