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5 enfoques de desconvolución de objetivos en el descubrimiento de fármacos

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5 enfoques de desconvolución de objetivos en el descubrimiento de fármacos

La identificación retrospectiva de las dianas del fármaco que subyacen a una respuesta fenotípica observada se denomina deconvolución de la diana. La deconvolución de la diana se puede lograr mediante numerosos métodos que incluyen cromatografía de afinidad, clonación de expresión, micromatriz de proteínas, micromatriz de células con transfección inversa y supresión bioquímica..

Esta lista destaca cinco enfoques que se pueden aplicar a la deconvolución objetivo.

1. Cromatografía de afinidad


La deconvolución de la diana mediante cromatografía de afinidad se logra modificando la molécula pequeña ligando, se introduce un 'enlazador' que permite su inmovilización y luego el ligando inmovilizado se incuba con extractos de proteínas. Las proteínas no unidas se eliminan mediante lavado,dejando solo proteínas unidas, con una afinidad lo suficientemente fuerte por el ligando. Luego, las proteínas unidas se eluyen utilizando condiciones de tampón que interfieren con la interacción proteína-ligando diana. A continuación, se identifica la proteína diana, normalmente mediante espectrometría de masas o métodos de inmunodetección.

2. Expresión-clonación


La visualización de fagos, la visualización de ARNm y los sistemas de tres híbridos son ejemplos de tecnologías de clonación de expresión.

visualización de fagos

La visualización de fagos le permite presentar proteínas diana potenciales en la superficie del fago en forma de una biblioteca de fagos. Los fagos que muestran diferentes proteínas se exponen luego al candidato a fármaco de molécula pequeña inmovilizado. Fagos que tienen afinidada la molécula pequeña se 'capturan' y los fagos no unidos se eliminan mediante lavado. Los fagos unidos que muestran la proteína diana se eluyen y amplifican utilizando células huésped bacterianas. A continuación, se utiliza la secuenciación del ADN para identificar la proteína diana.

visualización de ARNm

la pantalla de ARNm es una in vitro enfoque mediante el cual se amplifica y transcribe una biblioteca de ADNc, los ARNm resultantes se ligan a un enlazador de ADN y in vitro la traducción se realiza para generar moléculas de fusión proteína-ARNm. Estas se purifican y se someten a transcripción inversa para crear una plantilla de ADNc que se usa para la amplificación más adelante. Las bibliotecas de moléculas de presentación de ARNm se incuban con el fármaco candidato inmovilizado y la proteína-ácido nucleico no unidoLos complejos se eliminan mediante lavado. El ADNc se amplifica PCR para producir una biblioteca enriquecida con proteínas que se unen al fármaco. Después de la selección posterior, se utiliza la secuenciación del ADN para identificar el ADNc.

sistemas de tres híbridos

Los sistemas de tres híbridos funcionan mediante la interacción de 3 partes. El primero está compuesto por un dominio de unión al ADN unido a un dominio de unión a ligando. El segundo está compuesto por el ligando unido a un candidato a fármaco de molécula pequeña. El tercer componentese compone de un dominio de activación transcripcional fusionado con una proteína un objetivo potencial del fármaco. Si el candidato a fármaco pequeño se asocia con la proteína, las tres secciones se conectan para formar un complejo trimérico, lo que da como resultado la expresión de un gen indicador, que se utilizapara medir la interacción.

3. Microarrays de proteínas


Los microarrays de proteínas permiten un análisis de alto rendimiento de las interacciones moleculares entre el objetivo y el fármaco candidato. Los objetivos de proteína que se analizarán primero se purifican y luego se inmovilizan en un portaobjetos de vidrio. El conjunto resultante presenta numerosos objetivos potenciales fijados en posiciones específicas. Se incuba con una versión etiquetada del fármaco candidato de molécula pequeña. Luego, la matriz se lava a fondo para eliminar las moléculas no unidas. Después del lavado, cualquier "punto" de señal de etiquetado restante indica una unión exitosa del fármaco-proteína. La ubicación de la etiquetaEl complejo fármaco-proteína se puede asignar a la proteína diana específica fijada en esa posición.

4. Microarreglo de células transfectadas inversamente


Los microarrays de células con 'transfección inversa' a veces se denominan microarrays 'vivos', ya que se utilizan células vivas que se transfectan con ADNc en lugar de proteínas. Las células transfectadas expresan ADNc específicos en diferentes ubicaciones del arreglo, el arreglo esEn consecuencia, se cubren en grupos de células que sobreexpresan proteínas específicas en posiciones específicas. Al igual que con los microarrays de proteínas, el microarray de células se incuba con una versión etiquetada del candidato a fármaco de molécula pequeña, lo que permite la detección de la proteína diana.

5. Supresión bioquímica


La supresión bioquímica es una estrategia alternativa para identificar objetivos de fármacos y componentes de la vía de señalización. A diferencia de muchas otras estrategias de deconvolución de objetivos, este enfoque no depende de la afinidad de una molécula por su objetivo biológico. La supresión bioquímica implica la adición de una molécula pequeña a extractos de proteínas, que inhibe una actividad de interés: la inhibición se mide mediante un ensayo de actividad. En primer lugar, se mezcla un extracto de proteína con una molécula que se sabe que inhibe la actividad de interés. A continuación, se fracciona un extracto de proteína no inhibido y se introduce en el extracto inhibido.Entonces es posible determinar si alguna de las fracciones suprime la inhibición. Si se identifica una fracción que suprime la actividad inhibidora de la molécula pequeña, se realizan más rondas de fraccionamiento para purificar la actividad supresora.


Referencias

Terstappen, G., Schlüpen, C., Raggiaschi, R. y Gaviraghi, G. 2007. Estrategias de deconvolución de objetivos en el descubrimiento de fármacos. Nature Reviews Drug Discovery, 6 11, 891-903. Doi: 10.1038/ nrd2410
Wermuth, C., Aldous, D., Raboisson, P. y Rognan, D. 2015. The Practice of Medicinal Chemistry 4a ed., Págs. 45-70.


Conozca al autor
Laura Elizabeth Lansdowne
Editor gerente
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