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Perspectiva de la industria

NGS durante la pandemia de COVID-19 y más allá

Perspectiva de la industria

NGS durante la pandemia de COVID-19 y más allá

La secuenciación de próxima generación NGS ha sido una herramienta fundamental utilizada durante la pandemia COVID-19, ayudando a los científicos a estudiar el genoma viral del SARS-CoV-2 e identificar mutaciones. La necesidad de mejorar la velocidad, la simplicidad y la rentabilidad sonimpulsando desarrollos en métodos de secuenciación como el Panel de medianoche - un método de enriquecimiento que puede reducir el tiempo de secuenciación a más de la mitad.

Redes tecnológicas recientemente hablé con el Dr. Nick Downey, líder de colaboraciones de NGS en IDT , para obtener más información sobre las formas en que se utiliza NGS como parte de la respuesta a la pandemia y obtener información sobre cómo y por qué esto varía a nivel mundial. En esta entrevista, Nick también nos cuenta más sobre el Panel de medianoche y comparte sus puntos de vista sobrecómo la pandemia ha influido en el uso futuro de los programas de secuenciación en la salud pública.

Anna MacDonald AM: ¿Puede describir el papel que jugó NGS durante la pandemia de COVID-19? ¿Por qué es tan importante estudiar el genoma viral del SARS-CoV-2?

Nick Downey Dakota del Norte :
En los primeros días de la pandemia, uno de los primeros pasos fue caracterizar el virus y comprender qué tan rápido se estaba propagando. Se usó NGS para decodificar la primera secuencia del SARS-CoV-2 muy temprano en el brote inicial, y estoLa secuencia fue el trampolín de muchas herramientas para frenar la pandemia. Primero, la secuencia inicial proporcionó información para realizar una investigación básica sobre ensayos efectivos para detectar el virus. Quizás lo más importante es que la secuencia temprana de SARS-CoV-2 permitió a los investigadores comenzar a construir reactivospara el desarrollo de las eventuales vacunas. La capacidad de comenzar este proceso tan temprano y de manera dirigida casi con certeza permitió que el desarrollo de la vacuna comenzara mucho antes que los brotes de enfermedades del pasado.

Pronto, los protocolos de enriquecimiento de NGS se estaban utilizando para reducir la cantidad de secuenciación requerida y permitieron que se probaran más muestras de investigación simultáneamente. La obtención de estos datos identificó la aparición de nuevas cepas como B.1.1.7 alfa, B.1.351 beta, P.1 gamma y, más recientemente, B.1.617.2 delta. La identificación temprana de una nueva cepa permite a los investigadores iniciar estudios que proporcionen datos para la evaluación de la salud pública antes. Vimos esto con los casosalrededor de las mutaciones mencionadas. La identificación de las variantes desencadenó estudios de investigación sobre su infectividad, capacidad para evadir las respuestas inmunitarias y propagación geográfica.

Con el lanzamiento de las vacunas, existe una mayor preocupación en torno a una nueva cepa que podría evitar la respuesta inmunitaria, y esto se puede evaluar en función de los datos del genoma. Cuando se realiza a gran escala, los investigadores pueden utilizar esta información para estudiar la eficacia de la vacunabasados ​​en variantes circulantes y proporcionan datos importantes para evaluar si es posible que se requieran refuerzos de vacunas en el futuro.

AM: ¿De qué manera las estrategias NGS varían según el país? ¿Cuáles son las razones de estas diferencias?

ND :
El uso de NGS como parte de la respuesta al SARS-CoV-2 ha sido bastante diferente a nivel mundial. No creo que haya una sola razón para esto, y la mayoría de los países han actuado dentro de su situación. Un líder anterior en la secuenciación fue elReino Unido, y su gobierno se comprometieron a principios de la pandemia a utilizar NGS para rastrear secuencias virales con el objetivo de analizar el 10% de las muestras que dan positivo. Otros países han adoptado un enfoque más descentralizado y es posible que no hayan priorizado la secuenciación como medida de referencia.Este método ha evolucionado durante la pandemia a medida que las necesidades y los recursos cambian de un país a otro.

Establecer una vigilancia secuencial nacional no es trivial. Una dificultad es que esto requiere una estrecha coordinación para compartir datos, por lo que los países con organizaciones más distribuidas enfrentan más dificultades que un país con una sola organización. Para algunos países, hubo pocos casos enel comienzo de la pandemia, por lo que la necesidad o utilidad percibida de la secuenciación puede haberse despriorizado en el contexto de otras iniciativas de salud pública. Y, por supuesto, la accesibilidad del equipo especializado y el personal capacitado son siempre un problema.CoV-2 en el pico de la pandemia no tenía la capacidad de realizar experimentos de secuenciación en conjunto.

AM: La OMS instó a los países a priorizar el aumento de la capacidad de secuenciación. ¿Qué desafíos deben superarse para mejorar la velocidad y el rendimiento de la secuenciación?

ND:
Los desafíos serán diferentes según la región o el país involucrado. Como se mencionó, la coordinación entre los grupos es necesaria para el intercambio de datos y la estandarización del formato de datos. Logística para llevar muestras positivas a una instalación de secuenciación, teniendo en cuenta la preparación / tratamiento de muestras diferentes enesas diferentes ubicaciones, y tener en cuenta las diferencias de órdenes de magnitud en la cantidad de material viral en la muestra, todo se suma a los desafíos para simplificar y acelerar el proceso de obtener material en un secuenciador. Y finalmente, a medida que aumenta los datos generados,necesita sistemas que puedan manejar el volumen y las conexiones para mover los datos a repositorios más centralizados.

Un desafío afortunado al que se enfrentan ahora algunos países es una caída drástica en las muestras positivas. Cuando la carga de casos es alta, las muestras positivas son abundantes y es fácil elegir muestras de Ct bajo para secuenciar. La caída en las muestras de títulos altos influye en la priorización de una mayor sensibilidadmétodos demasiado altos en todos los métodos.

Aunque a menudo se supone que aumentar el rendimiento requiere secuenciadores de gran capacidad, en realidad es un desafío técnico llenar estas máquinas. Cada muestra debe etiquetarse con un índice que se utiliza para identificar datos de diferentes muestras, y hay una cantidad limitada de índices disponibles.miles de muestras con etiquetas únicas requiere tiempo y esfuerzo. Además, los secuenciadores de gran capacidad tienden a funcionar durante períodos más largos para generar los datos. Por lo tanto, existe un equilibrio entre la velocidad y el costo, entre intentar cargar más muestras en una sola máquina o distribuirlas muestras en varias máquinas más pequeñas para ahorrar algunas horas la última opción también reduce la necesidad de esos índices.

AM: ¿Puede contarnos más sobre Panel de medianoche ? ¿Qué distingue a este método?

ND :
El panel de medianoche * fue diseñado por los doctores Nikki Freed y Olin Salinder en la Universidad de Massey en Nueva Zelanda y está diseñado para uso exclusivo en investigación. El método original está diseñado para su uso con la plataforma de secuenciación Oxford Nanopore. El panel consta de un cebador de PCR multiplexconjuntos que copian una serie de amplicones de 1200 pb. Los cebadores se dividen en dos grupos para crear fragmentos del genoma del SARS-CoV-2 con un diseño superpuesto. Esto conduce a menos amplicones necesarios para cubrir el genoma. Eso, con el tiempo, da como resultado másAdemás, la menor cantidad de sitios de unión del cebador significa que hay una menor probabilidad de que una nueva variante inhiba la unión del cebador, lo que da como resultado la pérdida del amplicón.

Si bien los amplicones más largos pueden ser aún más atractivos, existe un equilibrio con la funcionalidad de la enzima transcriptasa inversa necesaria para copiar el ARN viral en el ADN para copiar regiones lo suficientemente grandes como para permitir la posterior amplificación. El Panel de medianoche equilibra este amplicónduración y desafío de la función de la transcriptasa inversa. Los amplicones más largos se han utilizado en las máquinas de secuenciación de Pacific Biosciences. Además, la biblioteca de secuenciación de amplicones se convierte fácilmente en bibliotecas de secuenciación compatibles con Illumina mediante fragmentación enzimática o sonicación.

AM: ¿Cómo cree que ha influido la pandemia en el uso futuro de los programas de secuenciación en la salud pública?

ND :
En retrospectiva, nos hemos dado cuenta de que el SARS-CoV-2 comenzó a circular en todo el mundo antes de lo que se creía originalmente, lo que hace que el control del virus sea un juego constante de recuperación. Dado que los virus respiratorios pueden propagarse rápidamente y al mismo tiempo causar síntomas superpuestos, algunos científicos están ansiosos por utilizar métodos no sesgados para monitorear constantemente las muestras de hospitalizaciones por enfermedades respiratorias. La PCR y las pruebas basadas en anticuerpos son adecuadas para proporcionar respuestas sí / no para agentes infecciosos conocidos, pero la secuenciación se adapta mucho mejor al tipo de ampliavigilancia que sería necesaria para detectar la rápida propagación de un virus nuevo o nuevas variantes.

Creo que la mayoría de los científicos involucrados en la secuenciación de muestras virales estarán muy a favor de la creación de programas de vigilancia continua. Estamos comenzando a ver signos de esto con los gobiernos del Reino Unido y Alemania que anunciaron recientemente programas de vigilancia global a largo plazo en colaboración con elOMS. A diferencia de la vigilancia anterior, estos tienen objetivos específicos en torno a la secuenciación de patógenos. Algo que no habría considerado hace algún tiempo son las pruebas de aguas residuales. Creo que esta podría ser otra vía que ayudará a identificar y rastrear patógenos. Las pruebas de aguas residuales no serán un pacientemedida de nivel, pero podría advertirnos de brotes focales antes de que otras formas de vigilancia puedan capturar un evento. Y la complejidad de estas muestras requiere el uso de plataformas y reactivos NGS ahora y en el futuro.

Nick Downey estaba hablando con Anna MacDonald, escritora científica de Technology Networks.

* RUO - Solo para uso de investigación. No para uso en procedimientos de diagnóstico. A menos que se acuerde lo contrario por escrito, IDT no pretende que estos productos se utilicen en aplicaciones clínicas y no garantiza su idoneidad o idoneidad para ningún uso de diagnóstico clínico.El comprador es el único responsable de todas las decisiones relacionadas con el uso de estos productos y cualquier obligación regulatoria o legal asociada.

Conozca al autor
Anna MacDonald
Escritor científico
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