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Introducción al ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas - Prueba ELISA

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Introducción al ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas - Prueba ELISA

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Hay muchos casos dentro de las ciencias de la vida en los que la detección y cuantificación de antígenos o anticuerpos dentro de una muestra de manera oportuna y rentable es importante. Desde la identificación de respuestas inmunes en individuos vacunados o infectados, hasta la detección de la expresión de una proteína que deseeexpresan en la superficie de una celda, para realizar pruebas de control de calidad. Tener una herramienta capaz de realizar tales evaluaciones es clave.

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ELISA es una de esas pruebas que ha demostrado ser invaluable como herramienta de investigación y diagnóstico. En este artículo, consideraremos qué es un ELISA, cómo funciona, variaciones de la técnica y quépuedo decirte.


¿Qué es una prueba ELISA?

Un ELISA es un ensayo inmunológico comúnmente utilizado para medir anticuerpos o antígenos, incluidas proteínas o glicoproteínas, en muestras biológicas. Como otros inmunoensayos dependen de la unión de anticuerpos a sus objetivos para facilitar la detección.


Por lo general, los ensayos ELISA se realizan en placas de 96 pocillos, un formato que los hace aptos para el cribado de muchas muestras a la vez. Suero, plasma, sobrenadantes de cultivos celulares, lisados ​​celulares, saliva, lisados ​​tisulares y orina son todos los tipos de muestras que se utilizan habitualmentepara estos ensayos, pero la mayoría de los tipos de muestras líquidas podrían usarse en teoría. Sin embargo, es importante tener en cuenta que algunos tipos de muestras pueden incluir factores inhibidores, como componentes tampón que comparten epítopos antigénicos similares 1 o factores como proteasas 2 que pueden dañar el objetivo o los componentes de detección, que pueden interferir con el rendimiento del ensayo.


Hay varios formatos de ensayo diferentes, pero todos se basan en la unión de la diana en sí o de un anticuerpo / antígeno capaz de capturar la diana en la superficie de la placa. Un paso de detección que involucra un antígeno conjugado, o más a menudo un anticuerpo, esluego se emplea para permitir que se detecte y cuantifique la unión exitosa, la mayoría de las veces mediante detección colorimétrica.


Tipos de diagrama de prueba ELISA y ELISA

El ELISA fue conceptualizado originalmente, de forma independiente, en 1971 por Eva Engvall y Peter Perlman 3 en la Universidad de Estocolmo en Suecia, y Anton Schuurs y Bauke van Weemen 4 en los Países Bajos. Buscaron un método de inmunoensayo capaz de detectar la presencia de antígenos o anticuerpos para reemplazar el radioinmunoensayo, que empleaba antígenos o anticuerpos marcados radiactivamente potencialmente peligrosos y, por lo tanto, idearon una alternativa basada en enzimas.


Ahora hay cuatro tipos principales de ELISA, directo, indirecto, sándwich y competitivo. Las imágenes a continuación Figura 1 ilustran la detección de antígenos; sin embargo, el mismo principio se aplica para la detección de anticuerpos esencialmente con las funciones del antígeno y el anticuerpo primarioinvertido.


Figura 1 :
Tipos de ELISA.


prueba ELISA directa

Con un ELISA directo, los antígenos o anticuerpos en una muestra se adsorben directamente en la placa de prueba de una manera no específica. A continuación, se aplica a los pocillos un anticuerpo de detección conjugado o un antígeno específico para la diana. A continuación, se realiza una detecciónel sustrato se utiliza para producir un cambio de color medible que se puede cuantificar en un lector de placas.


Como este ensayo tiene pocos pasos, es más rápido y ofrece menos oportunidades para la introducción de errores que los otros métodos ELISA. Sin embargo, como el paso de adsorción no es específico, el ruido de fondo puede ser alto. La ausencia de un anticuerpo secundariopaso significa que no hay amplificación de la señal, lo que reduce la sensibilidad del ensayo. También requiere la creación de anticuerpos / antígenos de detección conjugados para cada objetivo requerido.


prueba ELISA indirecta

desarrollado originalmente en 1978 5 para la detección de albúmina sérica humana, el ELISA indirecto, o iELISA, funciona de manera muy similar al ELISA directo, excepto por la adición de un paso de anticuerpo secundario. Esto permite la amplificación de la señal de prueba, superando la limitación de laELISA directo. También niega la necesidad de anticuerpos / antígenos de detección conjugados específicos del objetivo, ya que el anticuerpo secundario conjugado solo necesita ser específico de la especie para el anticuerpo primario. Cuando los antígenos totales de la muestra se unen a las placas, como el ELISA directo, el ruido de fondo permaneceSin embargo, si el ensayo se utiliza para la detección de anticuerpos de la muestra, el antígeno diana purificado se recubre en las placas, y el anticuerpo primario proviene de la muestra. Esto reduce en gran medida el ruido de fondo y, en consecuencia, estos ensayos son los más populares para determinar anticuerpos.títulos en muestras.


Las desventajas del ELISA indirecto incluyen un protocolo más largo con más oportunidades de errores y potencial de reactividad cruzada con el anticuerpo secundario.


ELISA sándwich

desarrollado en 1977 6 como su nombre indica, el ELISA sándwich empalma el antígeno entre los anticuerpos. La técnica puede emplear el formato ELISA directo o indirecto el ELISA sándwich que se muestra arriba se basa en el ELISA indirecto excepto que en lugar de la unión no específica de antígenosa la placa de ensayo, el anticuerpo de captura hace que este sea un proceso específico. Esta combinación mejora aún más la sensibilidad y la especificidad del ensayo.


Sin embargo, requieren la determinación de pares de anticuerpos de captura y detección compatibles para funcionar eficazmente con lo que la reactividad cruzada puede ser problemática. Este ensayo también suele tener la mayoría de los pasos, lo que ofrece una mayor oportunidad de error. Debido a la naturaleza selectiva dela etapa de unión al antígeno, los ELISA sándwich son particularmente útiles cuando el antígeno está en una mezcla compleja ya que no se requiere la purificación del antígeno.


ELISA competitivo

Un ELISA competitivo, también conocido como ELISA de inhibición o ELISA de bloqueo, es posiblemente la más compleja de las técnicas de ELISA. Desarrollada originalmente en 1976 7 para la detección de coriogonadotropina humana, el ensayo funciona detectando la interferencia a un nivel de señal de salida esperado, produciendo una relación inversa. Cuanto más objetivo haya en la muestra aplicada, menor será la señal de salida del ensayo. Múltiples formatosson posibles para lo cual los otros tipos de ELISA se pueden adaptar a un formato competitivo. Sin embargo, hay dos principios generales; el antígeno o anticuerpo de la muestra compite con una referencia por unirse a una cantidad limitada de anticuerpo o antígeno marcado, respectivamente. Alternativamente, muestrael antígeno o el anticuerpo pueden competir con una referencia marcada por unirse a una cantidad limitada de anticuerpo o antígeno, respectivamente.


El ELISA competitivo tendrá algunas de las mismas ventajas y limitaciones que el formato del que se ha adaptado. Sin embargo, puede ser útil cuando el antígeno es pequeño, lo que limita la capacidad de dos anticuerpos para unirse al mismo tiempo, como se requiere para elsándwich ELISA, o cuando solo hay un anticuerpo disponible.


pasos ELISA

Si bien existen variaciones en los protocolos para los diferentes tipos de ELISA, hay una serie de etapas del ensayo comunes a la mayoría que deben tenerse en cuenta.


revestimiento de placa

El primer paso en la mayoría de los ELISA es la unión del primer componente del ensayo a la placa de prueba. A menudo, esto se realiza mediante adsorción pasiva, que es un proceso no específico, por lo que el resultado dependerá de lo que se aplique alplaca. Si se aplica una muestra que contiene antígeno, entonces el resultado es una placa para la que aún se requieren pasos selectivos, ya que se unirá una variedad completa de antígenos, no solo los de interés. Sin embargo, si el antígeno purificado - como en el caso de un ELISA indirecto para la detección de anticuerpos - o captura de anticuerpos - como en el caso del ELISA sándwich - se aplica, entonces el resultado es una placa que ya tiene propiedades selectivas.


Varios tipos de placas, la mayoría de los cuales son poliestireno o derivados de poliestireno, con diferentes propiedades de unión, están disponibles según el objetivo y la naturaleza del ensayo. Algunos objetivos, que incluyen proteínas, carbohidratos, ADN, lípidos, péptidos cortos y proteínas muy glicosilados enpresencia de detergentes, no se adsorben bien. En estos casos, es aconsejable utilizar placas que hayan sido tratadas para permitir la unión covalente a la superficie.


incubaciones

Después de la adición de reactivos a las placas ELISA, deben incubarse para dejar tiempo para que se produzcan la unión o las reacciones. La temperatura y la duración de cada incubación dependerán del paso del ensayo y de la acción que se lleve a cabo. Incubación durante 1 horaa los 37 ° C se usa comúnmente, por ejemplo, después de la aplicación de la muestra. Sin embargo, pasos como el bloqueo se pueden realizar durante la noche en un refrigerador y la incubación durante la detección a menudo se realiza a temperatura ambiente durante períodos mucho más cortos.


Lavado

El lavado de la placa es un paso vital entre la aplicación de cada componente del ensayo hasta la detección. Después de vaciar las soluciones de los pocillos, los pocillos se lavan con un tampón - a menudo solución salina tamponada con fosfato-Tween 20 PBST - para eliminar los antígenos, anticuerpos o reactivos residuales no unidos que queden. Esto se puede hacer a mano con una pipeta multicanal o con un lavador de placas automático. Si no se lava lo suficiente, se puede producir una señal de fondo alta, mientras que lavar demasiado puede provocarseñales de muestra bajas. Es probable que un lavado inconsistente introduzca inconsistencias en la placa, lo que da como resultado resultados poco confiables.


bloqueo

Después del recubrimiento de las placas ELISA con proteínas, a menudo es necesario bloquear para evitar cualquier unión no específica de los anticuerpos de detección en los siguientes pasos del protocolo Figura 2. Se añaden proteínas mixtas no relacionadas con el ensayo y se incuban en la placa,ocupando cualquier sitio de unión no específico disponible. Las opciones comunes de tampón de bloqueo de proteínas incluyen leche desnatada en polvo, albúmina de suero bovino BSA y caseína. Alternativamente, los detergentes no iónicos, como Tween 20 o Triton X-100, se pueden usar como agentes de bloqueo, perono proporcionan un bloqueo permanente como las proteínas. El bloqueo ineficaz de la placa puede provocar un aumento del ruido de fondo y reducir la sensibilidad y especificidad del ensayo.


Figura 2:
Cómo el proceso de bloqueo evita la unión no específica.


anticuerpos

Los anticuerpos experimentales son la piedra angular de la mayoría de los ELISA y es de suma importancia elegir los adecuados, especialmente cuando se utilizan múltiples anticuerpos. Se pueden utilizar anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones. Los anticuerpos monoclonales ofrecen una altaespecificidad, pero son más costosos. Los anticuerpos policlonales, por otro lado, pueden unirse a un objetivo en múltiples sitios de unión, amplificando la señal y mejorando la sensibilidad.


El uso de métodos que emplean un anticuerpo secundario agrega pasos adicionales, prolongando el tiempo del ensayo, aumentando la posibilidad de errores y requiriendo una mayor optimización para encontrar un par de anticuerpos compatible apropiado. Sin embargo, las ganancias de sensibilidad por el uso de un anticuerpo secundario policlonal puedenhacer que esto valga la pena o sea esencial para el desarrollo de un ensayo eficaz.


detección

Independientemente del tipo de ELISA utilizado, todos terminan en un paso de detección, la mayoría de las veces utilizando una química de cambio de color visible mediada por enzimas que luego se puede medir usando espectrofotometría UV-Vis . Se aplica un antígeno o anticuerpo conjugado con enzima a los pocillos de prueba donde se unirá si su objetivo está presente. Cuando se agrega un sustrato apropiado para la enzima a la placa, se produce un cambio de color proporcional a la cantidad deobjetivo unido dentro del pozo. La peroxidasa de rábano picante HRP es un conjugado común que se usa en asociación con el sustrato 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina TMB, que se vuelve azul en respuesta a HRP y luego amarillo al agregaruna solución de ácido sulfúrico que detiene la reacción.


Los valores de absorbancia para cada pocillo se pueden determinar usando un lector de microplacas a 450 nm en el caso de TMB después de la adición de la solución de parada
- un tipo de espectrofotómetro UV-Vis - y correcciones y cálculos, como la resta de los valores promedio de los pozos en blanco, el promedio de las réplicas técnicas o el cálculo de la relación con los estándares, realizados de acuerdo con el diseño del ensayo.


En la Figura 3 se muestra un ejemplo de un flujo de trabajo de ELISA.


Figura 3 :
Ejemplo de un flujo de trabajo de iELISA.


Resultados de la prueba ELISA, ¿qué le dice una prueba ELISA positiva?

los resultados de ELISA pueden interpretarse cuantitativamente, cualitativamente o semicuantitativamente . En un ensayo cuantitativo, se usa una dilución en serie de un estándar conocido para permitir la generación de una curva estándar, normalmente de densidad óptica DO versus concentración. A partir de esto, las cantidades precisas de diana en las muestras desconocidas pueden sercalculado Figura 4.


Figura 4 :
Ejemplo de cálculo de la curva estándar y determinación de la concentración objetivo de una incógnita para un experimento ELISA.


En un ensayo cualitativo, los datos normalmente se recopilarán numéricamente mediante el uso de un lector de microplacas, pero los resultados se interpretarán como positivos o negativos en comparación con los pocillos en blanco y / o negativos sin curva estándar.


Los ensayos semicuantitativos también recopilan datos numéricos sin el uso de una dilución en serie o una curva estándar. Sin embargo, la inclusión de estándares tanto negativos como positivos, a menudo positivos altos y bajos, facilita la comparación relativa de niveles entre los pocillos de muestras desconocidas.Con el uso de estos estándares para monitorear la reproducibilidad del ensayo, se puede establecer un valor de corte con resultados por encima del umbral determinado como positivo y aquellos por debajo del negativo. Algunos ensayos también pueden incorporar una "zona ámbar".Para las muestras cuyos valores caen en esta región, se recomienda volver a realizar la prueba o realizar más investigaciones.


Si bien un ensayo cuantitativo puede ser deseable en algunos entornos, la inclusión de una curva estándar completa en cada placa ocupa pozos valiosos. Por lo tanto, existe una compensación dependiendo de la información que el usuario espera obtener del resultado del ensayo.


Como muchos ensayos, es poco probable que los resultados obtenidos de un ELISA sean 100% exactos, con la posibilidad de resultados falsos positivos y falsos negativos. En consecuencia, la mayoría de las pruebas se asociarán con medidas de sensibilidad y especificidad ; cuanto más cerca estén del 100%, mejor será la prueba.


Hay muchos factores que pueden afectar estos valores, como :

  • Fondo alto de unión no específica o reactividad cruzada
  • Poca afinidad de los anticuerpos por sus objetivos
  • Condiciones de ensayo subóptimas
  • Condición y complejidad de la muestra


Cálculo de valores de sensibilidad y especificidad por lo tanto, es un paso importante en el desarrollo de muchos ensayos ELISA, particularmente en un entorno de diagnóstico, para determinar qué tan informativos y confiables son los resultados obtenidos.


Aplicaciones de ELISA y la prueba LAM ELISA

Desde su concepción, esta prueba flexible y económica ha encontrado muchos usos y continúa haciéndolo. Algunas de estas aplicaciones se destacan a continuación.


diagnóstico de enfermedades infecciosas

El ELISA es particularmente popular en las pruebas de diagnóstico donde se puede aplicar a la detección tanto de los agentes infecciosos en sí mismos como de la respuesta de anticuerpos que inducen en el huésped, dependiendo de la conformación del ensayo elegida. En consecuencia, los ELISA pueden ser útiles tanto para identificarindividuos infectados que pueden representar una amenaza de infección o requerir tratamiento y en monitoreo epidemiológico para identificar individuos recuperados que han sido previamente infectados. Algunas infecciones crónicas, particularmente cuando la carga de agentes infecciosos aumenta y disminuye, pueden ser difíciles de detectar si se basan únicamente en la detección deel agente infeccioso. Sin embargo, se puede detectar una respuesta sostenida de anticuerpos 8 en estos individuos, incluso cuando el microbio en sí no puede, lo que ayuda a identificar a estos individuos.


La primera prueba universal para el virus de la inmunodeficiencia humana VIH 9 desarrollado en 1985, fue un ELISA para detectar la cistatina C sérica humana. Se pueden diagnosticar muchas otras enfermedades tanto en humanos como en animales usando un ELISA, incluida la fiebre del dengue 10 hepatitis B, 11 SARS-CoV-2, 12 , 13 Streptococcus equi 8 y Escherichia coli. 14


El ELISA de lipoarabinomanano LAM se desarrolló para detectar LAM, un antígeno inmunogénico de la pared celular micobacteriana, en la orina de pacientes con tuberculosis TB. Dada la prevalencia mundial y las tasas de mortalidad asociadas con la tuberculosis y los desafíos de los diagnósticos alternativos de la tuberculosis, esuna herramienta de detección muy necesaria. Sin embargo, ha habido críticas sobre su nivel de sensibilidad 15 y utilidad clínica. 16 Sin embargo, se están realizando esfuerzos recientes para abordar estos problemas. 17 Se han realizado esfuerzos para extender la prueba a otros tipos de muestras, incluido el esputo 18 y suero, pero con menos éxito.


Detección de alérgenos alimentarios

alérgenos 19 puede ser potencialmente fatal si las personas afectadas lo ingieren, por lo que es vital que cualquier alimento declarado libre de ciertos alérgenos, como el maní, 20 son exactamente eso. El ELISA proporciona una excelente sensibilidad para este propósito, hasta partes por millón ppm en algunos casos, y es capaz de hacer frente a algunos tipos de alimentos, como aceites y leches, como los métodos alternativos PCR puede tener problemas. Sin embargo, algunos procesos de alimentos, como el calentamiento, que pueden cambiar la conformación del alérgeno, pueden afectar negativamente 21 detección por ELISA.


prueba de biosimilares

Con el desarrollo de medicamentos biosimilares, es necesario demostrar su similitud con los medicamentos de referencia que buscan emular. También aquí los ELISA han encontrado utilidad 22 en factores determinantes como la concentración total de fármaco.


prueba de biomarcadores de cáncer

biomarcadores de cáncer 23 a menudo son detectables en muestras de sangre. Por lo tanto, la prueba ELISA se puede utilizar como un método no invasivo para detectar y cuantificar biomarcadores conocidos.


pruebas de drogas forenses

Los toxicólogos pueden utilizar ELISA para examinar muestras forenses en busca de rastros de drogas de abuso 24 incluidas anfetaminas, cocaína, opiáceos, metadona, benzodiazepinas y cannabinoides. Si bien las muestras líquidas, como orina o sangre, son más fáciles, también es posible procesar muestras sólidas, como cabello, para análisis ELISA.


prueba de embarazo

Gonadotropina coriónica humana hCG, una hormona producida durante el embarazo 25 puede detectarse mediante ELISA en muestras de orina.


enfermedad autoinmune

marcadores indicativos de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide 26 y lupus 27 puede detectarse y cuantificarse mediante ELISA.


Referencias

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Karen Steward PhD
Escritor científico senior
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